使用高分辨率呼吸测定法分析 Drosophila melanogaster PINK1^B9 缺失突变体中的线粒体功能

我们的研究采用黑腹果蝇（drosophila melanogaster）作为实验模型，以探究线粒体功能在疾病和化学毒性中的作用。我们希望回答的一些问题是：百草枯（PQ）如何影响线粒体功能，以及这种影响如何与帕金森病相关联？我们如何预防或逆转与此突变相关的线粒体功能障碍？

高分辨率呼吸测定需要经过适当培训，才能精确操作并进行数据分析。此外，系统使用者无法同时处理多个样品，也不具备高通量分析的能力。由于每次最多只能同时运行两个样品，实验设计必须明确细致。

我们在粉红基因缺失突变体的渐进性环境中发现，线粒体功能表现为氧化磷酸化C1偶联以及电子传递链C1和C2偶联的降低，并伴随ATP生成从氧化磷酸化途径向其他代谢途径的转变。这些发现与帕金森病突变的疾病病理生理学密切相关。高分辨率呼吸测定技术的关键优势之一在于其能够直接、准确地测量氧气消耗速率，从而评估线粒体功能和细胞代谢。

此外，该方法具有良好的通用性，可用于多种类型的样本，包括分离的线粒体。考虑到线粒体功能障碍是帕金森病等神经退行性疾病的一个共同特征。

未来，我们将致力于研究线粒体功能和能量提升如何成为针对神经退行性疾病的治疗重要靶点。首先，向Arobaros反应室中加入两毫升MIRO 5缓冲液。用塞子封住反应室，注意避免引入气泡。

然后小心地拉动塞子，形成一个单独的气泡。打开 Arobaros DAT Lab 软件，在“块温度”（Block Temperature）字段中输入 25 摄氏度，然后点击连接至 XI GRA 2K。点击并选择用于保存校准数据的文件夹，然后点击保存。

当新窗口打开时，命名实验和样品，然后点击“保存”。接下来，进入布局菜单，选择第一个选项，即一，校准实验。

图三，温度。当红线显示为一条标准的直线且周围点接近零皮摩尔时，选择两个点，分别对应A室和B室；在屏幕右侧选择氧浓度。选中标记点，并复制与该点对应的温度和大气压值。

将这些数值粘贴到下方的输入框中，然后单击校准并复制到剪贴板。接着转到文件菜单，选择保存并断开连接。完成极谱式氧气传感器的校准后，取下密封塞并打开反应室。

用100%乙醇、70%乙醇和蒸馏水清洗塞子和腔室。将果蝇转移至微量离心管中。向管中加入200 µL预冷的MiRO5缓冲液，并用研杵轻轻研磨4到6次，使果蝇匀浆化。

使用微量移液器将匀浆后的果蝇悬液转移至检测室中。用塞子盖住检测室，避免引入气泡。接下来，单击布局菜单并选择第五个选项“按校正体积流动”。此时会在“实验代码”区域弹出另一个新窗口，在样本字段中为该实验命名。

将每个样本分别命名为腔室 A 和 B。然后将单位字段设置为 unit，在浓度字段中，将腔室体积定义为每毫升一单位。开始高分辨率呼吸测定前，确保氧通量信号稳定在正值。加入皂苷（digitonin）以透化线粒体膜。

然后加入丙酮酸、苹果酸和脯氨酸底物，直至氧通量上升并趋于稳定。按下键盘上的 F4 键，并输入试剂名称以标记该事件。加入 ADP 以偶联线粒体呼吸链，并等待氧通量的上升和稳定。

然后加入琥珀酸，并测量氧通量；为抑制ATP合酶，加入寡霉素，并观察氧通量是否下降。待红线稳定后，使用0.25微摩尔FCCP解偶联线粒体电子传递，直至达到最大氧消耗，表现为红线升高。接着加入复合体I抑制剂鱼藤酮，等待氧通量下降并趋于稳定。

然后加入抗霉素复合体三抑制剂，等待氧通量下降，随后上升并趋于稳定。点击Graph Pad Prism软件，从图表中提取氧通量数值。

氧化磷酸化C1是指加入ADP后氧气通量的数值。然后使用给定公式计算氧化磷酸化C2。利用以下方程，计算解偶联剂和抑制剂作用下的ETS C1和C2氧气值。随后，通过氧化磷酸化与质子漏之间的差值计算ATP合成量。

最后，计算氧化磷酸化与漏氧速率的比值，以确定呼吸控制比。与对照组果蝇相比，pink1B9-null果蝇在氧化磷酸化C1态以及氧化磷酸化C1和C2态下的氧通量均显著降低。此外，pink1B9-null果蝇在ETS C1态、ETS C2态以及ETS C1和C2态下的氧通量也较低，表明其电子传递系统功能受损。

与对照组果蝇相比，电子传递链中电子流的中断影响了氧化磷酸化过程，导致pink1B9-null果蝇的ATP合成减少。突变果蝇呼吸控制比的降低表明线粒体存在解偶联现象，提示线粒体利用氧气生成ATP的效率降低。