用于冷冻电子显微镜的单层石墨烯包被载网的制备

目前，如何最优地保存生物样品是在获得高分辨率冷冻电镜（cryo-EM）结构过程中面临的主要挑战之一。在样品制备过程中，样品会暴露于具有疏水性的气-水界面，该界面会对样品产生变性作用，并可能导致原本稳定的样品在冰层中产生优势取向，从而阻碍高分辨率结构的解析。为解决与气-水界面相互作用相关的问题，通常采用在cryo-EM载网上覆盖一层薄碳膜或类似氧化石墨烯的柔软材料的方法。

然而，这些涂层通常会增加图像中的背景噪声，从而降低结构的分辨率。使用单层石墨烯包被载网可实现类似的保护作用，同时不会引入显著的背景噪声。采用石墨烯包被的冷冻电镜载网有助于克服与气液界面相互作用相关的问题。

然而，商用石墨烯载网价格昂贵，且许多实验室认为在本实验室制备石墨烯载网过于复杂。冷冻电镜领域的研究人员现在可使用本逐步操作方案，在一天内成功制备出数十片高质量的石墨烯。首先，在通风橱内，将带有胶带固定石墨烯片的盖玻片放置于自制的旋涂仪上。

佩戴安全护目镜，使用玻璃移液管将两滴甲基丙烯酸甲酯（MMA）滴加到石墨烯表面，并立即以最高速度开始旋转。旋转过程中，在中心再添加两滴，继续旋转一分钟。将三个结晶皿清洗并干燥后，分别向其中各倒入200毫升氯仿、丙酮和异丙醇。

将夹紧型透射电镜载网支架底座置于盛有200毫升氯仿的第一个培养皿底部。确保有孔薄膜一侧朝上，将载网从载网盒中逐个转移至支架底座的孔中。用铝箔覆盖培养皿，并将其放置于旋转摇床上，轻轻振荡30分钟。

接下来，将金属盖放在网格支架块上，以固定网格，便于转移至下一个结晶皿。使用弯头叉和长镊子，小心地将网格支架块从皿中取出，放入第二个含有200毫升丙酮的皿底部。取下网格支架块上的盖子，并在轨道摇床上轻轻振荡。

30分钟后，将盖子盖在载网支架块上，并将其转移至含有200毫升异丙醇的培养皿中，以去除丙酮残留。取下载网支架块的盖子，轻轻振荡20分钟。将载网逐个从载网支架块转移至铺有吸水纸的玻璃培养皿中，转移时确保带孔薄膜面朝上。

将清洁后的载网有孔薄膜面朝上转移至湿润的滤纸上。将疏水性载网垂直浸入水中，以防止因水的表面张力导致载网弯曲。将浸没的载网排列成方形阵列，保持彼此靠近但不重叠。

用更多去离子水填充网格涂层槽，确保水面高于网格至少五毫米。要从培养皿中捞取MMA石墨烯薄膜，需将盖玻片缓慢地以一定角度插入培养皿中，位置应远离石墨烯薄膜。将盖玻片置于石墨烯MMA薄膜下方，并使其边缘与薄膜边缘平行对齐。

然后将盖玻片从水中垂直提起，使MMA石墨烯薄膜随之带出。通过以45度角将盖玻片缓慢浸入水中，将MMA石墨烯薄膜转移至水槽中，使薄膜脱离盖玻片并漂浮在水面上。在水位下降之前，将MMA石墨烯薄膜定位在载网的上方。

使用尖端已熔融封闭的巴斯德移液管，小心调整MMA石墨烯薄膜的位置。用注射器缓慢降低液面，使MMA石墨烯薄膜准确地落在载网上，并完全覆盖其表面。使用一对洁净干燥的镊子，将夹持载网的吸水纸转移至洁净无尘的培养皿中。

将夹紧型透射电镜载网支架底座置于第一个含有200毫升新鲜丙酮的结晶皿底部。将每张载网从吸水纸上单独转移至支架底座的孔中，确保甲基丙烯酸甲酯（MMA）面朝上。用铝箔覆盖结晶皿，并在旋转摇床上轻轻振荡30分钟。

将金属盖盖在网格支架块上以固定网格。然后使用弯头叉或长镊子小心地将支架块从培养皿中取出，并放入盛有200毫升新鲜丙酮的第二个培养皿底部。从支架块上取下盖子后，在旋转摇床上轻轻振荡30分钟。

将盖子重新盖在网格支架块上，并将其转移至含有200毫升异丙醇的培养皿中。在轻轻振荡前取下盖子，振荡20分钟。将网格转移至一个铺有吸水纸的小型玻璃培养皿中，室温下晾干10分钟。

在透射电子显微镜（TEM）衍射模式下，覆盖有单层石墨烯的EM载网显示出对应于石墨烯六方晶格的布拉格衍射峰。石墨烯载网对样品具有富集效应，这一点在比较施加于完全金载网（有或无石墨烯支撑）的脱铁铁蛋白时可观察到。对石墨烯覆盖的金载网上脱铁铁蛋白的冷冻电镜图像进行快速傅里叶变换，同样显示出对应于六方石墨烯晶格的布拉格衍射峰。