使用新型机器人系统Spotiton进行时间分辨研究的冷冻电子显微镜载网制备

利用 Spotiton 机器人系统，可在电子显微镜载网上以快至 90 毫秒的速度将目标蛋白与其相互作用伙伴混合并玻璃化。该方案能够捕获那些因存在时间过短而无法通过标准载网制备技术捕捉的蛋白质中间构象。时间分辨的 Spotiton 技术可用于研究亚秒级的生物学或生物化学过程，例如膜通道的激活、DNA 或 RNA 的合成，以及药物或抗体与其靶蛋白的早期相互作用。

用户必须同时管理多个直接影响载网质量的组件。在使用前需充分了解系统，并在制备载网时保持耐心。首先，打开氮气供应罐的主阀门，并确保系统储液罐中已充满脱气的超纯水。

打开计算机和多插座电源板上的 Spotiton 系统。单击桌面图标以启动 Spotiton 软件的用户界面。在“工具”菜单中，选择“初始化平台”以初始化并归位三轴机器人及旋转分配头组件，在初始化和归位前需确保分配头的尖端朝下。

在主菜单中，单击“转至安全位置”以将机器人移至安全位置。在“吸液”选项卡中，选择“预冲洗”以用储液槽中的水多次冲洗分配头。持续操作，直至观察到从吸头末端流出两股连续不断的水流。

在“检查”选项卡中，将探针一移至检查摄像头下方，进行水液滴喷射测试，并调节振幅直至产生离散的液滴。按下上方摄像头监视器中的“录制”按钮，记录探针一喷射过程的视频。将探针二移至检查摄像头下方。

在右侧显示器中回放第一个喷嘴喷射的视频，同时在上方摄像头显示器中触发第二个喷嘴，使两个分配器的液滴生成模式相匹配。使用提供的内六角扳手，从网格机器人支架上取下镊子。在附近的实验台面上，将一块测试网格的纳米线面向上放置在网格块的边缘处。

小心抓住载网边缘，将其正确放置在镊子中，然后重新安装镊子。在 Cryo 选项卡中，点击“Tip to Camera”以将尖端一移至上方浸入路径相机的视野中，并确保上方相机监视器中已选择“Live”模式。

打开并调节上方摄像头的光源。通过在显示器内单击鼠标，将尖端一调整至上方摄像头视野中可见的位置。单击“Grid to Camera”以将网格置于上方摄像头前方，然后根据需要再次调整尖端一的位置。

在“Cryo”选项卡中，确保未选中“Vitrified Grid”，然后依次点击“Queue Target”和“Plunge”。通过评估上方和下方的图像，确认分配器工作正常。使用适当的缓冲液将两个样品稀释至所需浓度，理想情况下对两者使用相同的缓冲液，并用液氮填充冷冻剂杯。

使用5瓦的氢气和氧气，以1.5分钟为起始点，对三到四个纳米线网格进行等离子清洗。插入雾化器，并观察蒸汽从雾化器帽的中心孔排出。在主窗口中观察实时湿度监测器，或在“报告”和“环境”下打开环境湿度追踪器。

检查腔室和防护区的湿度水平。将每个样本的五微升加入样本杯中。将样本杯装入承载托盘，左侧为用于探针一的样本，右侧为用于探针二的样本。

然后将托盘推回仪器内直至到位。在“吸液”选项卡中，设置每个吸头的吸液体积为三微升。确保样本托盘已牢固放置，点击“吸液”，观察移液装置将分配头移入样本杯中。

通过取下样本杯并观察液面下降，确认两个样本均成功吸取。在“检查”选项卡中，将每个吸头送至检测摄像头，以确认吸头无堵塞且能够正常排液。根据需要调整振幅，使每个吸头的液滴形成情况保持一致。

将一块新近经等离子清洗的载网装入镊子中，但暂不安装镊子。确保湿度水平升高至约 90% 至 95%。填充乙烷杯，并在检查相机前方对两个喷射尖端进行最后一次试喷，确认无任何堵塞。在“Cryo”选项卡中，单击“Tip to Camera”。

检查乙烷杯。若已形成乙烷冰，可根据需要使用额外的乙烷气体将其融化。将载有载网的镊子安装到载网台上。

在“Cryo”选项卡中，单击“Grid to Camera”，确保尖端一在上方相机监视器中位置正确。然后依次单击“Vitrified Grid”、“Queue Target”和“Plunge”。当系统提示时，单击“OK”，以命令网格机器人将网格从乙烷转移至液氮中，并释放到浸没的支架上。

检查载网图像，以确定是否应保留或弃用。若需保留载网，请预冷尖头镊子，轻轻夹住载网边缘，将其放入载网盒的槽位中，从缺口左侧的第一个槽位开始，按顺时针方向依次放置。通过选择“报告”和“实验”，使用实验查看器回顾和比较上、下摄像头拍摄的载网图像，以及在 plunge 时的仪器设置和湿度测量数据。

此处展示了在单次时间分辨 Spotiton 实验中，将 RNA 聚合酶与一段含有启动子序列的 105 碱基对 DNA 寡核苷酸混合 150 毫秒后迅速玻璃化冷冻所制备的网格图像。在六个网格中，仅有一个显示出欠佳的吸滤效果。玻璃化网格上的冰沉积模式与上部相机图像中观察到的液滴沉积模式高度一致。

混合样品在覆盖纳米线的网格条上能有效爬升，样品很少溢出到其所在方格相邻的方格中。在充满冰的方格中，冰的厚度通常在方格中心区域的孔洞中最厚，而靠近网格条的孔洞中则逐渐变薄。由于紧邻纳米线，紧靠网格条的孔洞通常为空。

正确制备和处理纳米线载网将确保在混合样品载网上形成良好的冰层厚度。Spotiton 系统还允许用户将两种样品分别沉积在同一载网上，从而在同一次载网维护过程中采集未混合的对照样品。Spotiton 已助力实现了对细菌基因表达过程中首批中间态的实时捕获。

由于它们在亚秒级时间尺度上形成，其结构至今一直未知。