一种用于骨缝扩张小鼠模型中骨重塑的三维可视化技术

对颅面缝的研究兴趣源于临床需求，旨在理解正畸和正颌治疗的机制。本研究旨在建立标准化的颅缝扩张小鼠模型，以及用于研究颅缝扩张过程中缝合线力学生物学编码变化和骨重建的三维可视化方法。我们结合了PEGASOS组织透明化技术与病毒标记方法，以从空间视角获取颅缝和骨重建的多维度信息。

该模型适用于不同年龄的多种转基因小鼠。可随时方便地调节拉伸应力的大小和撤回力。利用PEGASOS技术，我们能够观察颅缝干细胞在骨重塑过程中的三维时空分布。

利用PEGASOS技术，我们将进一步探究这类干细胞与机械应力之间的关系及其具体机制。首先准备两个固位夹，使用细线钳和一根0.014英寸的澳大利亚钢丝制作螺旋环。

然后，准备定制的不锈钢弹簧，并将弹簧剪成合适的长度。同时，准备一根长度为七毫米的直型澳大利亚丝或直钢丝，并剪下两片直径为两毫米的纸片作为屏障。接下来，将麻醉后的小鼠放置于手术台上，并使用脱毛膏或剃毛器小心去除头部上方的毛发。

然后，使用碘伏和75%酒精交替消毒小鼠的头皮。将小鼠头部朝上放置，并用手术胶带将其四肢固定在手术台上。接着，使用手术剪在靠近小鼠颈部的头皮处做一个弧形皮瓣，充分暴露矢状缝及周围颅骨。

然后，在手术台上用6-0缝线固定头皮瓣。干燥颅骨后，用37%磷酸进行酸蚀处理20秒。接着，使用生理盐水清洗酸蚀区域。

将两个固定器置于顶骨两侧，距矢状缝3毫米处，并使用光固化粘合剂将其粘牢。然后，将头皮瓣复位，标记固定器的位置，并在相应位置的头皮上剪开两个小孔。通过小孔同时穿出小环，将头皮瓣复位，使小环露出皮肤表面。

安装弹簧和引导丝时，将弹簧剪裁至比两个固定夹之间距离长一毫米。压缩压力弹簧，并将其置于两侧的小线圈之间。将不锈钢丝穿过小线圈和弹簧，然后释放弹簧，以获得约30G的初始推力。

接下来，在弹簧与夹持器之间放置两片小纸片，并使用光固化粘合剂将其粘合，以在弹簧两端建立屏障。扩张后，采用微型CT观察颅缝的变化。与对照组相比，施加力量一天后颅缝逐渐且显著地扩张，五天后骨边缘出现绒毛状骨性突起。

此外，通过双标记法观察矿化情况显示，施加力学载荷显著激活了成骨过程。在缝扩张后的第七天即观察到新形成的矿化骨，表明骨重建过程已经开始。首先，用胶带固定麻醉小鼠的四肢，将腹部皮肤向上提起，沿胸廓周缘小心剪开，充分暴露胸腔。

用眼科剪在右心房做一小切口，立即在左心室心尖处插入一根灌注用22号针头。然后通过注射器推注30至50毫升心脏灌注液。当右心房流出的液体完全变澄清后，灌注等体积的4%PFA溶液。

解剖组织和器官，并在4°C条件下用4% PFA固定过夜。为诱导组织脱钙，将固定的硬组织置于10毫升EDTA溶液中，在37°C摇床上孵育。孵育约两天，每天更换溶液一次。

将固定的颅骨置于 20 毫升 25% Quadral 溶液中以进行组织脱色。在 37 摄氏度摇床中孵育一天，并更换一次液体。随后，将组织依次放入 30% 叔丁醇（TB）溶液、50% TB 溶液和 70% TB 溶液中，进行梯度脱脂。

随后，将样品和TB PEG溶液置于37摄氏度的摇床中脱水六小时。最后，将完全脱水的组织置于37摄氏度摇床上的BB PEG溶液中。孵育两至四小时后，组织将变为透明。

PEGASOS 组织透明化方法使组织变得透明。经整体 EDU 染色的透明组织显示标记效率高且保存良好。在对照组中，多个 EDU 阳性细胞在缝线组织中呈弥散分布。

缝线扩张一天后，可在缝线的中部和边缘观察到增殖的细胞。随着缝线逐渐增宽，增殖细胞的数量随时间推移而减少。绿色标记的细胞是骨髓中的小圆形细胞，与EDU阳性的缝线细胞不同。