通过多光子显微镜观察血管生成 在体 内 用于颅骨临界骨缺损修复的基因修饰3D-PLGA/nHAp支架

本实验的总体目标是通过双光子显微镜实时观察三维支架中体内血管的形成过程。这些测量对于骨组织再生领域中的关键科学问题至关重要，例如如何实时监测并揭示三维支架中体内血管形成的动态过程。该技术的一个优势在于，它能够同时在活体条件下对细胞外基质及周围分子网络进行可视化观察。

首先，制备含有20克PLGA和20毫升1,4-二氧六环的均相溶液。然后，向该溶液中加入2克粉末状nHAP。使用磁力搅拌器，在室温下以1500 rpm的速度剧烈搅拌悬浮液16小时，形成均匀的糊状物，用于打印多孔PLGA/nHAP支架。

打印完成后，将支架冷冻干燥48小时，以彻底去除任何溶剂。然后在75%乙醇中灭菌1小时。随后，再次进行冻干，以获得中性、无菌的材料。

接下来，向每个支架中加入4.5 × 10⁵个慢病毒颗粒，并将支架置于保持37°C的湿润培养箱中孵育2小时，使病毒颗粒充分吸附。慢病毒颗粒吸附完成后，用2 mL PBS将支架洗涤两次，以去除未结合的残留物。将洗涤后的支架在液氮中快速冷冻。

再次冻融后，将样品于零下80摄氏度保存，以供后续研究。将先前包被有4.5 × 10⁵个携带绿色荧光蛋白的慢病毒颗粒的3D支架转移至2.0 mL冻存管中，每管加入1 mL完全DMEM培养基，于37摄氏度振荡培养5天。每隔12小时，收集含有从支架释放的慢病毒颗粒的1 mL培养基样本，并补充1 mL新鲜培养基。

转导 HEK293T 细胞时，首先从 12 孔板中培养的 HEK293T 细胞中移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞两次。随后，向洗涤后的 HEK293T 细胞中加入一毫升先前收集的培养基，在 37 摄氏度的湿润培养箱中孵育 48 小时。孵育 48 小时后，通过流式细胞术检测 GFB 阳性 HEK293T 细胞的数量，以确定具有生物活性的慢病毒颗粒数量。

首先，将C57黑鼠六号小鼠随机分为三组，每组14只，分别为对照组、PH组和PHp组。对麻醉后的小鼠头部皮肤进行剃毛，并依次使用碘酊和75%酒精溶液对皮肤表面进行消毒。将小鼠头部固定于立体定位仪中，使用手术刀切开皮肤，再用剪刀做一条长约1厘米的直线切口。

使用无菌棉签刮除颅骨骨膜，暴露其表面。然后，在颅骨左侧，用环钻钻出一个直径为4毫米的临界尺寸骨缺损。将支架移植至骨缺损处。

使用眼科镊子轻轻将骨膜覆盖于手术部位。随后，每厘米切口缝合三针以关闭伤口。最后，给予镇痛剂布托啡诺以控制术后疼痛，并将动物置于加热垫上以维持其体温，直至其苏醒。

当小鼠恢复意识后，为其提供食物和水，并持续监测其日常活动直至实验结束。组装多光子显微成像系统用于双光子激发荧光（TPEF）和二次谐波产生（SHG）成像后，将飞秒钛宝石激光器调至860纳米。为观察新生血管，经静脉向小鼠注射200微升浓度为10毫克/毫升的葡聚糖生理盐水溶液，然后使用立体定位仪将麻醉后的小鼠固定在加热板上，以维持其体温在37摄氏度。

向小鼠腹腔注射 200 微升生理盐水，以防止脱水。最后，给予动物由 3% 异氟烷与 100% 氧气组成的混合气体，以在成像过程中维持充分的麻醉和镇痛。开始成像时，扫描一对检流计镜，以创建一个 512 乘 512 微米的采样区域。

然后，使用NA为1.0的水浸物镜，将激发光束聚焦于样品上，并收集背向散射的双光子激发荧光（TPEF）HSG信号。设置视场范围，在对照组中应覆盖正常骨组织区域及缺损边缘；而在对PH组或PHp组动物进行成像时，仅覆盖植入的支架部分。随后，对缺损区域的五个不同位点进行扫描。

在两小时的成像期间内，每12秒获取一次图像序列。图中展示了采用3D打印技术制备的支架照片，以及显示所制备材料整体孔隙率的显微CT图像。支架的微孔结构由一张在5000倍放大条件下获得的扫描电镜（SEM）图像展示。

如图所示，用含有从支架释放的慢病毒颗粒的培养基处理的HEK293T细胞高效表达了绿色荧光蛋白。根据流式细胞术估算，释放的病毒颗粒总数达到约40%。在实验开始的前24小时内观察到最显著的释放效果，并随时间逐渐减弱，证实了包被在支架上的慢病毒颗粒可维持其生物学活性长达96小时。

对颅骨缺损内形成的血管进行的活体分析显示，在支架移植后八周，对照组小鼠中无法检测到新生血管，而在PH组和PHp组中则清晰可见新血管。此外，尽管在PH组和PHp组中均检测到多处胶原沉积位点，但只有在PHp组中可观察到数量逐渐增加的细小血管长入支架，且总体血管面积差异显著。一旦掌握该技术，若操作得当，可在两小时内完成。

在进行该操作时，重要的是要记住固定小鼠的头部，以在扫描过程中保持其静止，避免产生任何伪影。完成该操作后，还可进行其他方法，例如光声成像，以提供额外的数据，如深层组织图像。该技术问世后，为骨再生领域的研究人员探索移植中的血管生成奠定了基础。

观看本视频后，您应能够充分理解如何实时观察体内三维支架中血浆的形成过程，以及微光子显微镜技术的应用。