利用炎症性肠病患者来源的肠道类器官在犬类肠芯片中实现三维形态发生

我们的研究目标是建立一种利用与人类相似的动物（特别是犬类）肠道细胞培养三维结构的方法。目前，肠道细胞形态发生的研究主要依赖实验室动物模型，但这类模型成本高、耗时长，且无法准确模拟人类的发育过程。此外，传统的静态二维细胞培养模型难以模拟三维管状结构的复杂空间组织。

将源自肠道类器官的单个细胞贴附到包被细胞外基质（ECM）的聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面一直是一个重大挑战。解决该挑战的关键步骤包括通过表面活化确保ECM均匀包被，并使其过夜干燥。将源自患者的犬类类器官技术与体外三维形态发生技术相结合，为开展慢性多因素疾病的转化研究提供了有前景的途径，符合“同一健康”倡议（One Health Initiative）的理念。

用于犬类炎症性肠病研究的“肠道芯片”（Gut-on-a-Chip）方案为比较医学提供了一种可重复的模型，可用于肠道形态发生、宿主-微生物组相互作用、感染、药物和益生菌筛选等方面的研究，并具有跨物种应用的潜力。首先，将肠道芯片装置置于60摄氏度的干燥烘箱中30分钟，以去除水分。随后使用紫外臭氧发生器，对装置进行60分钟的紫外光和臭氧处理。

使用长尾夹固定上层微通道的进样管、旁路管和出样管。夹紧下层微通道的进样管，然后断开下层微通道的出样管。确保下层微通道的旁路管保持开放状态。

使用P100移液器，通过下层微通道的出口孔加入100微升1%的聚乙烯亚胺溶液。重新连接下层微通道的出口管路。使用长尾夹固定下层微通道的入口旁路和出口管路，随后固定上层微通道的入口管路。

现在断开上层微通道的出口管路，确保旁路管路保持开放。接着，通过上层微通道的出口孔加入100 µL的1%聚乙烯亚胺溶液。重新连接上层微通道的出口管路，并将装置在室温下孵育10分钟。

用0.1%戊二醛重复上述操作，然后用去离子水冲洗，以去除多余的表面活化溶液，随后将芯片置于60摄氏度的烘箱中过夜干燥。第二天，从烘箱中取出芯片，并在生物安全柜中冷却10分钟。使用长尾夹固定上层微通道的进样口、旁路和出样口管路，以及下层微通道的进样口管路。

断开下层微通道的出口管路。通过下层微通道的出口孔加入 20 微升细胞外基质（ECM）混合物。然后重新连接下层微通道的出口管路。

使用长尾夹固定下层微通道的进样管、旁路管和出样管，包括上层微通道的进样管。断开上层微通道的出样管后，通过上层微通道的出样孔加入 20 µL VCM 混合物。重新连接上层微通道的出样管，然后取下下层通道出样管上的长尾夹，确保两条出样管均处于开放状态。

将芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育1小时。首先，配制含有10微摩尔Y-27632和2.5微摩尔CHIR99021的类器官培养基。将细胞外基质涂覆到 Gut-on-a-Chip 上后，断开上部微通道的出口管路，同时保持上部微通道的旁路管路开放。

使用长尾夹固定下层微通道的入口和出口。用 P100 微量移液器将 20 微升细胞悬液加入上层微通道的出口孔中。使用长尾夹固定上层微通道的旁路和入口管路。

将出口管路重新连接到上层微通道的出口孔，确保在整个过程中管路保持开放。完成后，使用长尾夹逐渐固定上层微通道的出口管路。接着，在显微镜下确认细胞在上层微通道内分布均匀。将 Gut-on-a-Chip 装置置于37摄氏度的湿润化二氧化碳培养箱中。

将连接至芯片上层微通道的注射器与放置在培养箱内的注射泵相连。设定流速为 30 微升每小时，并启动上层微通道灌注液的持续流动。在此期间，保持下层微通道处于夹闭状态。

接种后的第二天，将培养基更换为仅含 A8301 的类器官培养基。当上层微通道形成单层细胞后，开始向底层微通道持续灌注培养基。接着，将类器官培养基引入上层和下层微通道，以启动芯片中三维形态发生的发育过程。

将流速提高至每小时 50 微升，以在肠芯片设计中实现每平方厘米 0.02 达因的剪切应力。使用计算机调控的生物反应器，对培养在肠芯片装置上的细胞施加 10% 的循环应变和 0.15 赫兹的频率，持续两到三天，以建立三维形态发生。在培养基流动六至九天后，可在整个微通道中观察到犬肠上皮细胞三维形态发生的偶发性聚集。

免疫荧光染色评估了类器官来源的单层细胞及微流控芯片中绒毛样结构的三维构型。通过TEER测量的肠道屏障功能显示，培养第5天时TEER值稳定。