用于分析肠道黏膜免疫反应的免疫健全肠芯片模型

我们的研究聚焦于免疫健全的器官芯片平台的开发与应用。通过构建这些具有生理相关性的人源化体外模型，我们能够研究复杂的宿主-病原体相互作用。我们所获得的知识可用于调控并鉴定感染性疾病治疗中的分子靶点。

一个关键挑战是在体外维持宿主组织与处于稳态条件下的活性微生物群共存。这包括重建隐窝和绒毛结构的器官型三维拓扑结构及其微生物定植。肠芯片平台通过利用流体流动塑造器官型结构并防止细菌过度生长，从而应对这一挑战。

这可确保稳定的培养条件。与其他现有的类肠芯片平台相比，由于本模型包含了原代组织驻留免疫细胞，因此能够对人类免疫系统对病原体的反应进行详细研究。此外，该模型的尺寸允许在单次实验中获得多种检测结果，从而降低了总体实验成本和实验次数。

我们的实验室致力于利用诱导性多能干细胞开发自体系统，以实现个体化医疗。首先，用含镁和钙的DPBS将胶原蛋白储备液稀释至1:100。向相应的培养腔中加入350微升稀释后的储备液，并在室温下孵育5分钟。

使用 350 微升含镁和钙的 DPBS 将所有腔室冲洗两次，以洗去残留的胶原蛋白和乙酸。从一个位点取下塞子并将其切换到另一侧。再次冲洗腔室后，向其中加入 350 微升内皮细胞生长培养基。

将插头从一个位点取下并切换到另一侧。然后，向每个腔室中加入 350 µL 内皮细胞生长培养基。取传代 1-3 代、在内皮细胞生长培养基中培养且细胞融合度达到 80% 至 90% 的 HUVEC。

然后，从T25细胞培养瓶中移除细胞培养基，用3至5毫升不含镁和钙的DPBS轻柔洗涤细胞。去除溶液后，加入1毫升胰蛋白酶消化试剂，在37摄氏度孵育5分钟，直至细胞从培养瓶壁脱落。将脱落的细胞用9毫升含5%FBS的不含镁和钙的PBS缓冲液转移至离心管中，在室温下以350 ×g离心5分钟。

转移上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升内皮细胞生长培养基中。将相应体积的细胞加入腔室，并将生物芯片置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育。24小时后，用350微升内皮细胞生长培养基更换含HUVEC的腔室中的培养基。

如果微流控生物芯片中出现气泡，请关闭除受影响腔室端口外的所有端口。倾斜芯片，使气泡移向腔体一端。从另一端的端口注入700 µL细胞培养基，同时按住对侧的塞子。

首先，使用消毒剂彻底清洁培养箱和蠕动泵的所有区域，以确保准无菌环境。然后，用含镁和钙的 PBS 各冲洗每根管路 700 微升，接着用 500 微升 C2 或 EC 条件培养基冲洗。将鲁尔锁接头到蠕动泵塞之间距离较短的管路用于左侧腔室，另一侧对称的管路用于右侧腔室。

从培养箱中取出含有 HUVEC 和 C2BBe1 细胞的生物芯片后，对每个腔室进行培养基更换，体积为 350 微升。然后，将塞子从下部位置移至上部位置。向生物芯片的下腔室中加入 350 微升新鲜培养基。

随后，移除所有堵头，并将所有端口注满至最顶端。从左侧腔室开始，将鲁尔锁接头插入生物芯片的端口，将第一根导管连接到上层腔室的右侧端口。然后，将第二根导管连接到下层腔室的左侧端口。

接下来，取一个储液槽，并在储液槽底部加入一小滴细胞培养基。然后，将该储液槽插入第一根导管的对侧，并对另一个腔室重复此操作。当所有端口均连接至导管或储液槽后，向各储液槽中加入 3.5 毫升细胞培养基。

然后，将管路的松动端（其上连接有盖子）放置在储液池顶部，以封闭每个腔室的微流控系统。将生物芯片转移至蠕动泵。使用蠕动泵的夹具，将每根管路连接到蠕动泵上，使培养基从储液池流入腔室，并通过泵回流。

然后，以每分钟50微升的流速对每个腔室进行灌注。预灌注完成后，停止蠕动泵。取下与每个储液器管路相连的盖子，并将其放置在泵旁边的无菌纱布上。

移除所有培养基后，向储液池中加入两毫升新配制的培养基。重新连接盖子中的管路，以每分钟50微升的流速继续循环灌注24小时。停止蠕动泵后，打开所有腔室的储液池，排空储液池，并将管路和储液池从生物芯片上拆下。

用 500 微升含镁和钙的冷 PBS 缓冲液清洗微流控腔室，每个腔室清洗两次。向所有腔室中加入 500 微升冰甲醇。打开芯片后，剪切或移除生物芯片的封接膜。

将含有PET膜的组织切成两半，以便使用不同的免疫抗体组合平行染色。用精密镊子将每块膜转移至含有封闭和通透溶液的24孔板的不同孔中。然后，将膜片转移至湿盒内的洁净玻片上。

向每块膜上加入 50 µL 用染色液配制的一抗。将样品转移至 24 孔板后，用洗涤液洗涤膜两次，每次五分钟，随后用含镁和钙的 PBS 洗涤。使用荧光封片剂和盖玻片将膜片固定在洁净的载玻片上，并于 4 °C 保存，直至进行显微成像。

灌注五天后，经DAPI染色的细胞核DNA显示，单核细胞来源的巨噬细胞已完全分化，表达CD68，并广泛分布于血管组织中。人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成融合单层，通过形成如VE-钙黏蛋白等黏附连接结构，显示出组织完整性。此外，人脐静脉内皮细胞高表达血管性血友病因子（von Willebrand factor）。

灌注五天后，C2BBe1 细胞形成了表达连接蛋白 E-Cadherin 和 ZO-1 的极化上皮细胞层。灌注六天后，可在 z-stack 的 x 和 y 截面中观察到上皮细胞形成类似绒毛和隐窝结构的三维生长。