改良的视网膜劈裂铺片技术用于研究脊椎动物视网膜内核层神经元

我们的研究团队致力于探索视网膜中视觉信息处理的神经环路及突触机制。Morgans 实验室正在研究双极细胞中光适应的分子机制，而 Sivyer 实验室则关注内层视网膜神经元如何影响神经节细胞的功能。

在整体视网膜标本中获取内核层神经元是解剖学和生理学研究面临的一项挑战。虽然在垂直切片中可以接触到内核层神经元，但视野中的神经元数量极少。此外，切片会严重损伤神经元的侧向突起和连接，从而影响生理学研究。

在分离视网膜技术中去除感光细胞可显著改善抗体向内层视网膜的扩散，与传统的整体视网膜标本相比，内层视网膜靶标的免疫标记速度可提高20倍以上。分离视网膜技术还大大改善了膜片钳电生理记录过程中对内核层神经元的接触。该技术将为新的研究方法打开大门，并加快实验进程。例如，我们计划利用该技术，通过在双极细胞中表达通道视紫红质，研究双极细胞对黑视蛋白神经节细胞的输入。

使用宽口移液管，将一只小鼠眼球转移至一个新的培养皿中，培养皿内含有冰冷的新鲜Ames培养基。用一对镊子将眼球多余的结缔组织固定在培养皿底部，以稳定眼球。接着，用25号针头沿锯齿缘线刺穿眼球，为Vannas剪刀创建一个进入口。

使用环钻剪沿锯齿缘剪开，直至角膜分离。用一对镊子从眼杯中取出晶状体，然后使用宽口移液管将眼杯转移至含有大量持续通入碳氧混合气的艾姆斯溶液的培养皿中。将一个眼杯转移至盛有新鲜碳氧混合气饱和艾姆斯溶液的培养皿中。

使用Vannas剪刀从巩膜边缘向内做一小切口。用两把镊子小心地将巩膜从视网膜上剥离。接着，剪断连接巩膜与视网膜的视神经，然后用剪刀轻轻撬动，将视网膜从巩膜上分离下来以完成分离。

接下来，使用手术刀将视网膜切成两半或四等份。用宽口移液管将视网膜组织块放入大量持续通入碳氧混合气体的Ames培养基中。在进行视网膜分离之前，对另一只眼睛重复视网膜解剖操作。

首先，将含有小鼠视网膜的培养皿中的艾姆斯（Ames）培养基更换为新鲜的碳合艾姆斯培养基。使用宽口移液管将一块分离的小鼠视网膜转移至载玻片上，确保节细胞面朝上。用精细擦拭纸吸去多余液体，使其展平。

如有必要，在解剖显微镜下使用细头画笔轻轻将视网膜边缘拉平。用镊子将一片干燥的硝酸纤维素膜放置在视网膜上，使其贴附于神经节细胞一侧。将视网膜翻转，使硝酸纤维素膜朝下置于载玻片上，并在视网膜的光感受器一侧再放置另一片干燥的硝酸纤维素膜。

现在，用Ames培养基润湿画笔的笔尖。轻轻向下按压上层膜，以帮助其均匀贴附。接着，用一对镊子将下层膜固定在玻璃上，然后小心使用另一对镊子以缓慢而稳定的动作剥离上层膜。

弃去含有感光细胞的上层膜，将含有内层视网膜的下层膜放回通有碳氧混合气体的Ames培养基中。随后，将附有硝酸纤维素膜的分离小鼠视网膜置于冰上，浸入4%多聚甲醛溶液中固定30分钟。

接下来，用5至10毫升室温的PBS替换多聚甲醛，以洗涤分离的视网膜。在将分离的视网膜从硝酸纤维素膜上取下之前，使用疏水屏障笔在载玻片上绘制圆形孔穴。让孔穴在空气中干燥5至10分钟。随后，将分离的视网膜放入已制备好的孔穴中，并加入足量PBS使其完全浸没。

在解剖显微镜下，用精细的画笔轻轻抬起组织边缘，围绕视网膜画圈，使其与膜分离。使用镊子和画笔将膜从漂浮的视网膜片下方移除。然后小心吸除残留的PBS，使视网膜组织贴附在载玻片上，节细胞面朝下。

在分离的视网膜顶部进行突触素免疫荧光标记表明，光感受器的突触终末得以保留。然而，光感受器细胞核缺失，证实视网膜切分发生在光感受器轴突处。通过标记非双极细胞树突中的RGS11以及光感受器突触带中的CtBP2来评估突触完整性。

分离操作未对外丛状层中光感受器终末的形态造成损伤。使用近红外核染料评估了分离视网膜中RBC的存活率。观察到组织内细胞存活率存在区域差异，某些区域细胞死亡较多，但大部分RBC在分离后仍保持存活。

针对PKC alpha的红细胞免疫荧光标记以及针对calbindin-D的水平细胞标记显示，在分离的视网膜中孵育一小时后，抗体迅速扩散。