代谢失活细菌的方法学 秀丽隐杆线虫 研究

在秀丽隐杆线虫（C elegans）研究中，一个挑战是区分活体细菌饮食的影响与实验干预措施的影响。人们往往难以确定某种干预是直接作用于宿主，还是通过宿主与微生物组的相互作用间接影响线虫。经多聚甲醛处理的细菌能够解决细菌代谢效应与宿主生理效应难以分离的问题。

多聚甲醛处理具有高通量特性，且能稳定地使细菌失去复制能力和代谢活性。除了效果稳定外，经多聚甲醛处理的细菌仍可作为适口且富有营养的食物来源。首先将单个细菌菌落接种至500毫升锥形瓶中的200毫升无菌LB液体培养基中。

将细菌在37摄氏度的摇床培养箱中培养过夜。培养14小时后，检测细菌在600纳米处的光密度。将细菌分装至50毫升锥形管中，并于4摄氏度保存以备后续使用。

使用血清移液管将 50 毫升细菌培养物转移至一个新的 250 毫升锥形瓶中。标记活菌处理或模拟处理对照的试管。在洗涤前，使用血清移液管将 50 毫升细菌转移至一个 50 毫升的圆锥形离心管中，用于模拟处理对照。

在通风橱中，向细菌培养物中加入 781 微升多聚甲醛，使其终浓度为 0.5%。将使用过的枪头丢弃至固体废弃物化学危险品容器中。接着，用铝箔包裹烧瓶，并将其置于 37 摄氏度的摇床培养箱中孵育一小时。孵育完成后，洗涤细菌以去除残留的多聚甲醛。

为去除残留的多聚甲醛，使用移液管将处理后的细菌从锥形瓶转移至50毫升离心管中。随后，以约3000G的离心力离心处理后的细菌20分钟。将上清液弃入化学通风橱内的液体废弃物化学危害容器中。

现在向处理组和对照组的细菌沉淀中加入25毫升LB液体培养基，涡旋振荡以重新悬浮细菌沉淀。重复离心和重新悬浮沉淀步骤四次。为进行各项检测，将沉淀重悬于适当体积的溶液中。

进行寿命测定实验时，将重悬于10毫升LB液体培养基中的200微升细菌接种到60毫米培养皿上。将细菌储存在4摄氏度条件下。为检测细菌生长质量，使用无菌移液器吸头将制备好的细菌在LB液体培养基平板上划线。

为验证污染情况，将用于洗涤和重悬的LB肉汤在另一块平板上划线。随后将平板置于37摄氏度培养箱中过夜培养。次日，检查是否有细菌生长。

如果菌落未能在LB平板上生长，但甲醛溶液制备成功，则保存细菌。为使用呼吸仪检测细菌代谢活性，首先向96孔板的所有孔中各加入200微升校准液以水合传感器盒。将传感器盒放入96孔板中，并在37摄氏度下孵育过夜。

将仪器设置为混合、等待、测量和循环。第二天，将水化后的芯片放入仪器中。向一个新的96孔板中，向检测孔加入160微升M9培养基，随后加入40微升制备好的细菌。

向四个角落的孔中各加入 200 微升 M9 作为空白对照。加入 160 微升 M9 和 40 微升 LB 培养基作为阴性对照。最后，向其余未使用的孔中各加入 200 微升 M9。

然后在运行程序前，将已弹出的校准板替换为检测板。结果将以氧消耗速率的形式显示。不同菌株对多聚甲醛的失活响应时间各不相同。

例如，将 HB101 细菌暴露于 0.25% 的处理条件下一小时，足以使其代谢失活。而粪肠球菌（Enterococcus faecalis）则需要 1.0% 的浓度才能达到稳定的效果。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）对经处理的 OP50 菌株以及模拟处理的对照组表现出相似的偏好性。

然而，一种灵敏的成对检测方法显示，线虫对模拟处理的对照组具有更强的偏好。在经处理的OP50上生长的线虫比在模拟处理对照组上的线虫具有更高的吞咽速率。摄取经处理的细菌导致野生型线虫发育时间延迟，以及产卵能力下降。

无论食物来源如何，蠕虫的寿命之间没有显著差异。然而，在存在五氟二脱氧尿苷的情况下，经多聚甲醛处理的细菌可延长蠕虫的寿命。长寿命蠕虫品系摄取经多聚甲醛处理的细菌后，其寿命未发生改变。