小鼠颈动脉单细胞悬液制备用于单细胞测序

细胞存活率低以及细胞碎片较大是血管组织解离的主要难点。我们的两步细胞消化法非常适用于颈动脉组织的解离，经过少量修改后也可用于制备其他血管的单细胞悬液，因此在心血管研究中具有重要帮助。本方案适用于获取颈动脉中的多种细胞类型，且无需特殊设备即可轻松重复操作。

未来，我们计划利用单细胞铁测序技术发现的细胞亚群进行心血管疾病的靶向治疗。首先，用75%酒精喷洒已处死的小鼠。然后，使用无菌解剖剪剪开皮肤，暴露胸腔。

剪断膈肌。然后，继续向上剪至下颌，小心去除多余的结缔组织和脂肪，暴露颈动脉。接着，剪断下腔静脉，使血液从闭合的循环系统中流出。

使用注射器，将20毫升预冷的灌注液缓慢注入左心室。将小鼠置于体视显微镜下，用显微解剖剪剥离颈动脉周围的脂肪和结缔组织。分离颈动脉，并用PBS清洗以冲去残留血液。

将动脉转移至含有1.5% FBS并置于冰上的六孔板中。使用显微解剖剪沿纵轴解剖颈动脉，并将其平铺于另一个含有1毫升FBS并置于冰上的六孔板中。用FBS小心冲洗动脉内膜，以去除残留血液。

将动脉切成2毫米见方的组织块，转移至1.5毫升离心管中。在4°C下以400 ×g离心5分钟，使组织沉降至管底。弃去上清液，将组织重悬于500 µL解离试剂A中。将离心管置于37°C水浴中孵育1小时，每隔10分钟用1毫升移液器轻轻吹打一次。

然后，向离心管中加入 500 微升含 5% 胎牛血清（FBS）的溶液，充分混匀。将细胞悬液经无菌的 40 微米细胞滤网过滤至 1.5 毫升离心管中，离心后弃去上清液，再将沉淀重悬于 200 微升解离试剂 B 中。将离心管置于水浴中，使细胞完全解离成单细胞悬液。5 分钟后，加入 200 微升含 5% FBS 的溶液以终止消化反应。

将悬液离心后弃去上清液，再将沉淀物重悬于 100 µL 冰上预冷的 PBS 中。显微镜观察显示，与单独使用解离试剂 A 相比，联合使用解离试剂 B 与试剂 A 可更彻底地解离颈动脉组织。从九根左侧颈动脉中共收集到 176,000 个单细胞，大多数血管组织成功解离为单细胞，且细胞活性较高。

消化后，基于CIARA的无监督聚类揭示了正常小鼠颈动脉中的四种主要细胞类型。