斑马鱼幼虫肠道分离用于单细胞RNA测序

我们的研究旨在探究多种鱼类幼体在胃肠道发育和功能障碍过程中发生的转录组交换。本文提供了一种新方案，可实现斑马鱼肠道内不同细胞类型的分离，该方法在理解胃肠道健康与疾病方面具有潜在应用价值。近年来，人们日益关注发育和疾病过程中前部神经系统与其他肠道细胞类型之间相互作用的研究。

利用单细胞RNA测序等先进技术解析这些复杂的动态过程，有望揭示前部神经肌病的关键机制，从而实现更精准的诊断与治疗。通过本方案，我们成功鉴定出多种肠道细胞类型，包括上皮细胞、间质细胞、血细胞、肌肉细胞、免疫细胞，甚至肠神经节细胞——此前采用类似方法尚未能以如此丰富的数量捕获这些细胞类型。因此，我们提供了一种可靠的技术手段，可用于研究胃肠道在发育及功能障碍过程中的组成变化。

从相应的繁殖体系中获取野生型和转基因斑马鱼卵。取一个直径15厘米的培养皿，其中含有HEPES缓冲的E2培养基或E3培养基，从目标斑马鱼繁殖体系中收集适量的受精卵。将受精卵置于E3培养基中，在28°C条件下孵育，并维持适当的明暗循环。

在受精后一天（DPF）时，移除未受精的卵，并让已受精的卵继续发育至五天 DPF。在一天 DPF 时挑选转基因斑马鱼幼体。在进行全幼体解离前，使用 0.016% 三卡因麻醉五天 DPF 的野生型幼体，并将 30 条麻醉后的幼体转移至含有 1 毫升 10 倍浓度胰蛋白酶-EDTA 溶液的培养皿中。

然后，使用刀片在培养皿中将幼虫切成小块。将切碎的幼虫转移至含有 2 毫升 10 倍浓度胰蛋白酶-EDTA 溶液的微量离心管中，并将试管置于冰上静置 3 小时。每隔 1 小时，用 P1000 移液器将管内液体上下吹打，以促进组织解离。

首先，用 HEPES 缓冲的 E3 培养基或 E3 培养基制备 1.8% 琼脂糖平板。在解剖显微镜下操作，将六至十条麻醉后的幼鱼并排放置在琼脂糖平板上。用一根昆虫针固定每条幼鱼的头部。然后，用纸巾吸去平板上残留的 E3 培养基。

使用另一根昆虫针，从幼虫中分离出肠道，同时不干扰其他任何器官。确保彻底去除卵黄。分离后，检查肠道并清除所有非肠道组织，如皮肤、脂肪或肝脏。

使用镊子收集肠道，并将其转移至预置于冰上的微量离心管中的含10% FCS的PBS溶液中。在所有肠道解剖完成后立即进行离心，将微量离心管以13,800 ×g离心30秒。弃去上清液，保留约100微升液体在管中，以防止肠道组织干燥。

向管中的肠组织加入 500 微升木瓜蛋白酶溶液。加入 2.5 微升 1 摩尔的半胱氨酸以激活木瓜蛋白酶。然后将含有肠组织的管置于 37 摄氏度水浴中孵育 10 分钟。

五分钟后，将内容物上下吹打至半量，以促进酶解组织消化。通过预先润湿的35微米细胞筛网，将解离的细胞转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。加入含10% FCS的PBS溶液0.5毫升，重复洗涤数次，最终洗涤总体积达2毫升。

在4°C条件下，以700G离心收集的滤液5分钟，弃去上清液。在含有10% FCS的300微升PBS中加入终浓度为1微克/毫升的DAPI。将此混合液加入沉淀中并重悬，以标记死细胞。

然后，将样品置于冰上孵育5分钟，以确保在后续的FACS分析中排除死细胞。为了对从斑马鱼幼鱼中分离的肠道细胞进行荧光激活细胞分选（FACS），使用野生型完整幼鱼样品，在流式细胞仪上记录3,000个细胞，以设定待分选细胞群的门控参数。使用100微米喷嘴，并将分选精度设置为四路纯度。

将含有200微升PBS（含5%胎牛血清）的收集管放入流式细胞分选仪中。加载从分离的肠道组织制备的细胞悬液，排除双联体和死细胞后，将活细胞或DAPI阴性单细胞分选至收集管中。细胞分选后立即将收集管置于冰上。

使用台盼蓝进行活率检测，用血细胞计数板对悬液中的细胞数量进行计数。细胞现已准备好用于单细胞RNA测序。每个样本使用约20,000个细胞。