用于空间转录组学分析的斑马鱼幼虫切片的空间紧凑排列

在Morhardt实验室，我们使用斑马鱼作为动物模型来研究膀胱的发育和功能。我们已鉴定出斑马鱼中具有充盈和排空功能的泌尿膀胱。尽管斑马鱼体型较小，但我们希望利用其体型优势，以经济高效的方式应用空间转录组学技术，并结合我们对脊椎动物膀胱的理解开展研究。

如果未对试剂和设备进行优化，空间转录组学技术的成本可能迅速升高。本方案提供了一种经过验证的优化方法，并以斑马鱼为例，阐述了预期结果以及可能因技术本身引发问题的应对策略。除了实现昂贵的空间转录组学技术的经济化利用外，本研究还使我们能够在多个年龄阶段对基本完整的器官进行大规模空间转录组分析，同时最大限度地减少批次效应。

首先，将冷冻切片机冷却至 22 摄氏度，并准备好所有所需物品。准备一个一次性塑料模具用于样品定位。在底模内侧贴上一条实验室胶带，并用永久性记号笔在其上画一条直线作为参考标记。

标记底模内侧，以确保在冷冻切片过程中样品方向正确。在预冷包埋剂瓶的喷嘴后，将所需量的包埋剂注入底模的一角。缓慢倾斜底模，使包埋剂均匀分布。

现在，将含有冷冻介质的底模置于冰浴中，孵育至少10分钟，以冷却介质。接着，在通风橱内的冰桶中按1:1比例加入100%乙醇和干冰。将一次性铝制培养皿或小船放入冰浴中，并将冰桶盖上，静置5至10分钟。

将鱼浸入4 °C水中10分钟后，收集已处死的鱼。使用尖头镊子夹住尾鳍取出鱼体，并轻轻将其压在无绒吸水纸上以吸干水分。将制备好的底模置于体视显微镜下，放大倍数设为10倍。

将样品沿参考点以正确方向置于模具中。轻轻在样品上覆盖另一层冷冻介质。使用解剖学参考点将鱼精确对准底模内的标记线，并用尖头镊子调整方向，避免产生气泡。

将一块干冰贴在样品下方的底模底部，直至样品局部冻结固定。在完全冻结前，保持水平状态，以防止样品错位。现在将带有样品的底模放入盛有干冰和乙醇的铝制舟或容器中。

确保船体保持漂浮在表面，且基底模具保持干燥。盖上浴槽，使样品冷冻10分钟。随后，用铝箔包裹冷冻的基底模具，并将其储存在-80摄氏度的冰箱中，直至准备切片。

将冷冻的底模移至预冷的冷冻切片机中进行冰冻切片，并放入切片机腔室内。从储存处取出空间成像载玻片后，将其放入预冷的载玻片架中。将装有空间成像载玻片的载玻片架置于22摄氏度的冷冻切片机腔室内，待准备收集切片时使用。

现在，将冷冻的样品从底座模具中取出，并将其放入装有新鲜冷冻介质的样品夹中，确保切面朝向切片刀。然后在冷冻切片机中安装一把新的精细切片刀。将模具与刀片对齐后，修切目标区域，建议修切厚度为 20 至 50 微米。

确保将模具内的标记转移至冷冻组织块上，以保证样本的正确方位。修块时调整模具，使切面与冷冻介质中的参考标记保持平行。从冷冻组织块上切下切片，并将其展贴于标准的正电荷载玻片上。

在明场显微镜下检查切片区域，确认修块已完成。随后将空间成像载玻片从冷冻切片机腔室中取出，并置于4°C的冰浴中，同时保持其位于载玻片架内。开始进行冷冻切片，推荐厚度为10至14微米。

将切片逐片收集到带正电荷的载玻片上，直至到达目标区域。现在从冰浴中取出单细胞空间成像用载玻片，并将其从持片架上取下。使用细尖毛笔逐行收集切片，以防止切片卷曲。

然后用画笔的背面将空的冷冻包埋剂一角按压在刀片台上。以载玻片的上端作为支点，缓慢将载玻片放下至切片上，使其附着三秒钟后再抬起。将连续切片相互平行排列，以最大化利用载玻片上的空间。

采集完目标区域的切片后，将载玻片放回载玻片架中。若无需更多样本，可在分析前将载玻片于80摄氏度保存最多两周。在目标区域前后采集的切片应收集到标准的带正电荷的显微镜载玻片上，并进行苏木精和伊红染色，以评估样本的对齐情况和切片质量，然后再进行后续分析。

通过比较同一切片中各切片段的结构，验证了多段切片的对齐效果。对包埋和收集步骤的调整使得更多切片能够容纳于空间转录组芯片的成像区域内。在组织区域内的空间转录组信号质量较高，而在芯片空白区域信号质量较低，原因是信号复杂度较低。