一种用于药物开发的全人源肝细胞培养系统

TruVivo 的开发旨在满足对一种便捷且稳健的体外平台的需求，该平台能够维持表型稳定且功能完整的原代人肝细胞。由于具备这些特性，该系统可作为回答临床前药物开发相关广泛问题的基础平台。其中一个挑战是需要构建一种多细胞系统，既具有回答当前科学问题所需的生物学复杂性，又依然易于使用。

现有的系统通常难以长期维持肝细胞的形态和功能，或在建立常规、可重复的结果方面存在技术挑战。使用 TruVivo，用户仍可依赖传统二维细胞培养技术的简便性和灵活性。此外，该系统无需特殊设备，且适用于传统的分析方法。

借助 TruVivo，我们现在能够在化合物进入临床前评估之前，更准确地预测其代谢清除率、主要代谢产物、关键消除途径以及其他药代动力学性质，尤其是半衰期较长的化合物。首先，在37摄氏度水浴中解冻每种饲养细胞解冻培养基、补充剂A、补充剂B和补充剂C各一瓶。或者，可在4摄氏度冰箱中冷藏16至24小时。

将每瓶解冻后的培养基全部转移至一个15毫升或50毫升的锥形管中。为配制完全铺板培养基，取一瓶铺板培养基，先加入4.5毫升的补充剂B，随后加入11毫升的补充剂A。另取一瓶，加入100毫升培养基、1毫升补充剂C和14毫升补充剂A，混匀以制备完全培养基。

将剩余的补充剂 C 和补充剂 A 保存在 -20 摄氏度，直至第二周培养基的配制。开始时，将饲养层细胞在 37 摄氏度水浴中解冻 1 到 2 分钟。解冻后立即置于冰上。

在生物安全柜内采用无菌技术操作，将刚解冻的细胞加入10毫升饲养细胞解冻培养基中。然后使用1,000微升移液器吸取1毫升解冻培养基中的细胞悬液，冲洗空的细胞冻存管，并将冲洗液合并至其余细胞悬液中。在室温下以400G离心力离心4分钟。

小心吸除上清液，避免扰动细胞沉淀。将沉淀重悬于1 mL完全铺板培养基中后，计数饲养细胞。然后用完全铺板培养基稀释细胞悬液。

接下来，将稀释后的细胞悬液每孔500 µL接种至胶原包被的24孔板中。通过先在南北方向来回振荡两次，再在东西方向进行同样动作，以北、南、东、西的顺序摇动培养板。最后，在接种原代人肝细胞之前，将培养板进行孵育。

在解冻用于接种的肝细胞之前，先检查饲养细胞的贴壁情况。在饲养细胞培养近一小时后，进行原代人肝细胞（PHHs）的铺板操作。具体操作如下：饲养细胞培养30分钟后，将预热的肝细胞解冻培养基通过0.2微米的聚醚砜滤器过滤。

将原代人肝细胞（PHHs）在37摄氏度水浴中解冻1至2分钟。解冻后立即置于冰上。随后在生物安全柜中，将解冻后的细胞转移至肝细胞解冻培养基中。

使用1,000微升移液器，将一毫升解冻液中的肝细胞悬液转移回冻存管中，通过轻柔吹打洗涤管壁3至4次。将洗涤液与管中其余细胞悬液合并。盖紧管盖，轻轻倒置解冻后的原代人肝细胞（PHH）悬液5次。

在室温下以100×g离心8分钟。小心弃去上清液，可通过真空抽吸或移液操作，注意不要扰动细胞沉淀。然后沿含有沉淀的锥形管管壁加入3 mL完全铺板培养基。

轻轻左右摇动锥形管以重新悬浮细胞沉淀，并加入5 mL完全铺板培养基。计数重新悬浮的肝细胞后，用完全铺板培养基将细胞悬液调整至所需的接种密度。接着，取预先接种了饲养细胞的胶原包被24孔板，使用移液器或真空抽吸法去除饲养细胞的培养基。

立即将500微升稀释后的肝细胞悬液接种至含有饲养层细胞的每个孔中。通过先在南北方向来回摇动两次，再在东西方向进行相同的摇动，以“北、南、东、西”的顺序轻轻震荡培养板。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育2至4小时。

在培养的前60分钟内，每15分钟轻轻摇动培养板一次，操作方法如前所述。孵育结束后，将培养板从培养箱转移至生物安全柜中。摇匀后，使用移液器或真空抽吸法去除完全铺板培养基。

立即向每个孔中加入 500 µL 预热的完全培养基。在培养的第 7 天和第 14 天，获取了来自两位供体的 PHH 细胞在不同接种密度下与饲养细胞共同培养的图像。不同接种密度在汇合度上表现出明显的视觉差异，但均保持了典型的肝细胞立方状形态。