利用人诱导多能干细胞来源的肝细胞样细胞进行药物发现

本实验的总体目标是以适用于高通量筛选的方式，将人诱导性多能干细胞分化为类肝细胞。肝细胞在实验室中难以培养，但可通过诱导性多能干细胞生成，从而为肝病治疗方案的筛选提供平台。该技术的主要优势在于，可从任何肝病患者来源的细胞中无限量地生成具有疾病表型的肝细胞，实现在实验室中重现该疾病。

该方法建立起来相对简便，即使没有干细胞生物学的深厚知识也能操作。其可重复性使研究人员能够筛选成千上万种化合物，而无需复杂的机器人系统。今天的操作将由博士后研究员 Ray Liu 和研究生 Paige Lamprecht 进行演示。

首先，用含有钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）将融合蛋白 Ecad 稀释至 15 微克/毫升。用 5 毫升稀释后的基质包被 100 毫米的悬浮组织培养皿，并在 37°C 下孵育至少 1 小时。孵育结束后，移除基质，替换为 5 毫升 iPSC 培养基。

从液氮中取出一管冻存的人诱导多能干细胞。在37摄氏度下解冻，直至仅剩微小冰晶。然后，轻轻将细胞移入含有4毫升培养基的无菌15毫升锥形管中。

将细胞在300 G条件下离心五分钟。弃去上清液，用五毫升添加了10 µM Y-27632（一种Rho相关卷曲螺旋蛋白激酶的选择性抑制剂）的培养基轻柔重悬细胞。随后，移除Ecad包被的10 mm悬浮组织培养皿中的培养基，并加入五毫升上述细胞悬液。

当iPSCs生长至约80%融合度时，移除培养基，并用无钙、无镁的DPBS洗涤一次。吸除DPBS，加入足量0.02%EDTA溶液覆盖培养皿。随后，于室温孵育细胞最多三分钟。

一旦细胞开始脱落，立即移除0.02% EDTA溶液，并向培养皿中加入10 mL M培养基以释放细胞。通过轻柔吹打促进iPSC的脱离。将悬浮细胞的1/10转移至含有5 mL M培养基的新鲜Ecad包被的组织培养皿中。

将培养物在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下孵育，每天更换培养基。取一管250微升冰上保存的基质储备液（浓度为2毫克/毫升），在冰上解冻。随后，用预冷的移液器将解冻后的基质与10毫升冷的DMEM/F12培养基轻轻混合，使其终浓度为0.05毫克/毫升。

将100微升稀释后的基质转移至96孔组织培养板的每孔中。将培养板置于37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下孵育至少1小时。孵育结束后，弃去基质，每孔加入50微升M培养基，对剩余的培养板重复相同的包被步骤。

现在，将iPSCs在100毫米培养皿中培养，直至细胞融合度接近80%。从每个100毫米培养皿中收获iPSCs时，吸除培养基，并用5毫升DPBS冲洗。弃去冲洗液后，加入3毫升细胞解离溶液（如Accutase）。

然后，在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下孵育约两分钟。一旦细胞开始脱落，立即加入7毫升M培养基进行收集。反复吹打数次，将细胞集落解离为含有约3至6个细胞的小细胞团。

接下来，将iPSCs收集到一个15毫升无菌离心管中，在300 ×g条件下离心5分钟。离心结束后，吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于5毫升M培养基中。使用多通道移液器，每孔加入50微升细胞悬液，将细胞均匀分配至96孔基质包被板中。

然后，在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下将细胞培养过夜，并对剩余的培养板重复细胞接种步骤。通过显微镜检查96孔板，确保每个孔内的细胞覆盖至少70%的孔底表面。在分化第1天至第2天，将培养基更换为每孔100 µL基于RPMI的分化培养基。

然后，在37摄氏度、常氧及5%二氧化碳条件下培养细胞，每天更换培养基，持续两天。从分化第三天至第五天，将培养基更换为100微升含2% B27和100纳克/毫升活性NA的RPMI基础分化培养基。在37摄氏度、常氧及5%二氧化碳条件下继续培养三天，每天更换培养基。在分化第五天，每孔加入100微升0.02% EDTA溶液处理30秒，随后立即移除溶液。

加入100微升新鲜的RPMI基础分化培养基，并对剩余的培养板重复相同操作。在第6至第10天的分化期间，将培养基更换为100微升RPMI基础分化培养基。将细胞在37°C、4%氧气和5%二氧化碳条件下培养5天，每天更换培养基。

在第11至15天的分化阶段，将培养基更换为100微升基于RPMI的分化培养基，添加2% B27和20纳克/毫升HGF。将细胞在37摄氏度、4%氧气和5%二氧化碳条件下培养五天，每天更换培养基。在第16至20天的分化阶段，将培养基更换为添加了20纳克/毫升oncostatin-M的肝细胞培养基。

将细胞在37摄氏度、常氧及5%二氧化碳条件下培养五天，每天更换培养基。在第20天完成分化后，将培养基更换为100微升新鲜的肝细胞培养基，其中添加20纳克/毫升的抑癌蛋白M。继续孵育24小时后，将培养基收集至新的96孔板中，并于20摄氏度保存。

对剩余的孔板重复相同的收集步骤。向96孔板的每孔中加入90微升新鲜的肝细胞培养基，并补充oncostatin-M。从预先配制的工作储备液中，向每孔加入10微升选定的化合物。

向对照孔中加入 DMSO 至终浓度为 0.2%，以与处理样品中的终浓度一致。孵育 24 小时后，将培养基收集至新的 96 孔板中，并在 -20 °C 下保存。对剩余的各块培养板重复相同的收集步骤。

经过五天的处理后，细胞会表达定型内胚层特征性的蛋白。再经过五天的分化，内胚层转化为肝细胞命运，细胞表达FOXA2和HNF4a。添加HGF后，细胞表达胎儿肝细胞中常见的蛋白；分化完成时，细胞呈现立方状形态，细胞核含有明显的核仁，细胞质较大，并含有多个脂滴。

在分化第20天通过免疫染色检测HNF4a和白蛋白，结果显示这些肝细胞蛋白在所有孔中的分布相似。利用iPSC筛选降低APOB的化合物，以此为例说明iPSC来源的肝细胞可用于小分子筛选。APOB检测的z因子为0.73，证实该平台适用于药物发现。

针对每种化合物，计算了药物处理后与处理前的APOB比值。通过z分数分析确定了阳性结果。共鉴定出24个潜在阳性化合物，其APOB比值范围为0.86至0.44。

在排除对细胞活力有负面影响的化合物后，发现有两种化合物在降低 APOB 方面具有可重复性。一旦掌握，若操作得当，该技术可在 25 天内完成。在进行该实验过程中，需注意每天配制新鲜培养基。

由于组分降解导致的浓度不正确将改变细胞的分化能力。该技术开发完成后，为药物发现领域的研究人员利用人诱导性多能干细胞探索肝脏疾病的治疗方法铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何培养和维持人诱导性多能干细胞，并在小表面积压制形式下进行肝向分化，以用于高通量筛选。

请注意，操作人类诱导性多能干细胞可能具有极高的危险性，因此在进行本实验操作时，必须始终佩戴个人防护装备，例如手套和实验服。