从人胚胎干细胞群体中稳健生成肝细胞样细胞

以下实验的总体目标是生成均一水平的人类肝细胞，以在体外研究人类肝脏生物学。该过程首先利用在 A 和 WINT 三个 A 中具有活性的生理刺激，诱导人类胚胎干细胞（human ESCs）向定型内胚层分化。第二步是高效地将定型内胚层进一步诱导为肝内胚层。随后，将来源于人类胚胎干细胞的肝内胚层在体外成熟，以生成具有功能的人类肝细胞。

PCR、Western印迹、免疫荧光、ELISA以及药物代谢的结果表明，该方法可将人胚胎干细胞（ESCs）分化为肝细胞，效率约为90%。利用该技术，理论上我们可以无限量地生成具有显著人肝脏功能的原代人肝细胞。未来，这将有助于准确预测药物毒性，并提供人肝脏支持功能。关键在于驱动定向分化以及实现人细胞的核心密度。

该方法的可视化演示至关重要，因为核心细胞密度对于获得均一的细胞群体必不可少。我们已在四个国际地点培训了15名以上人员，使其成功掌握该技术。实验起始使用人胚胎干细胞培养物，并在基质胶包被的培养板中，采用添加了基础成纤维细胞生长因子（bFGF）的小鼠胚胎成纤维细胞条件培养基（ORM cm）进行传代培养。

在进行肝向分化之前，必须对维持培养的人胚胎干细胞进行仔细的表征。例如，这些细胞具有人胚胎干细胞的典型形态，并且表达多能干细胞标志物OCT4和Nanog，其表达水平与阳性对照H7人胚胎干细胞系相当。

此外，人胚胎干细胞对 SSEA-4 呈阳性。当人胚胎干细胞汇合度达到 30% 至 60% 时，用新配制的分化培养基替换 mTeSR1 培养基。为启动肝向分化，培养基应每 24 小时更换一次，持续三天。

三天后，细胞开始向内胚层表型分化，呈现三角形外观。将培养基更换为SR DMSO分化培养基，继续培养4至5天。

每48小时更换一次培养基。经过这一五天周期后，细胞将开始呈现肝细胞特征性的多边形形态。至第9天，人胚胎干细胞向肝内胚层的分化通过一系列显著的形态学变化得以体现。

此外，在为期九天的时间过程中，Octa four 的表达量逐渐下降。相比之下，甲胎蛋白（a FP）和白蛋白的肝脏转录本从第七天开始增加。随后，将细胞在终末培养基中继续成熟，并维持肝细胞表型九天，每 48 小时更换一次新鲜培养基。

最后，通过相差显微镜监测培养的细胞，观察其形态是否逐渐从尖锐的三角形转变为具有多边形外观的典型肝脏形态，以定量评估肝内胚层功能。对于细胞色素P450酶活性，特别是CYP3A4或CYP1A2，首先将第17天的细胞进行孵育。

将人胚胎干细胞来源的肝内胚层细胞与特定底物共同孵育，每组设三个重复。请记住使用组织培养基作为阴性对照，在37摄氏度下孵育五小时。收集上清液，并根据制造商说明书详细步骤测定基础酶活性的相对水平。

现在，针对每个样本，根据A-B-C-A-S法测定的每毫克蛋白质的酶活性进行计算。通过该体外成熟肝内胚层方法获得的典型培养物进行免疫染色，结果显示三种人类肝脏标志物——白蛋白、甲胎蛋白（a FP）和ein——呈均一表达。

观看本视频后，您应能充分理解如何高效地将人多能干细胞分化为肝细胞。一旦掌握该技术，便可每天进行操作，每百万细胞仅需投入约两分半钟。在分化过程中，每天观察细胞形态变化至关重要。