使用低成本染料可视化糖原积累和肠道完整性 秀丽隐杆线虫

线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）易于培养、保种、操作，可用于生物科学教学实验，也适合学生开展自主研究项目。本实验方案提供了两种简便且低成本的检测方法，均基于线虫身体透明的特性以及有色染料的使用。第一种方案可用于探究不同饮食条件下代谢链的变化，第二种方案可在较短时间内观察衰老过程。

这两种检测方法在资源有限的情况下用于教学都具有重要意义。第一种检测方法利用了线虫的透明特性及其能够产生并储存糖原的特点。通过使用卢戈氏碘液，我们可以对线虫进行染色，进而验证不同饮食或其他因素是否能够影响其糖原含量。

衰老是一个自然过程，但某些因素（如紫外线、食物和化学物质暴露）会加速这一过程。当使用某种试剂处理时，线虫的肠道屏障会发生改变，上皮完整性丧失，导致其摄入的物质发生泄漏。我们将这种检测称为“蓝染试验”（Smurf Test），因为当肠道完整性下降时，线虫会完全变成蓝色。首先，准备六块线虫生长培养基（Nematode Growth Media，NGM）琼脂平板。

第二天，在平板上加入 200 微升大肠杆菌 OP50 培养物，于室温下孵育一天。孵育结束后，在四个 NGM 琼脂平板上各加入 200 微升 0.025 摩尔的 D-葡萄糖，置于室温下使其干燥。从一个用于维持培养的 NGM 琼脂平板上，将不同发育阶段的三到四块秀丽隐杆线虫 Bristol N2 转移至新接种了大肠杆菌 OP50 的 NGM 平板上。

将秀丽隐杆线虫在20摄氏度、湿度高于95%的条件下培养三天。三天后，在培养皿中加入蒸馏水，用巴氏吸管收集线虫。将收集的线虫转移至50毫升离心管中，静置使其自然沉降，然后移除上清液。

然后，向离心管中加入蒸馏水。当管内液体体积减少至5毫升时，加入10毫升漂白液，并剧烈振荡离心管约6分钟。随后，用M9缓冲液将离心管补至50毫升，于1,400 ×g 离心3分钟。

吸除上清液至五毫升，向离心管中加入45毫升M9缓冲液。最后一次洗涤后，吸除上清液至上清液面位于15毫升刻度线处，将剩余液体转移至培养板中。在显微镜下观察培养板中卵的释放情况，并将培养板置于20摄氏度、湿度高于95%的环境中孵育14小时。

孵育后，将线虫收集到一个15毫升离心管中。使用自动移液器，取10微升同步化的线虫加至显微镜载玻片上。计数线虫数量，并计算获得每微升500至1,000条线虫所需的体积。

将500至1,000条处于幼虫一期（L1期）且已同步化的线虫转移至预先制备并接种了大肠杆菌OP50和葡萄糖的NGM琼脂平板上。在20摄氏度条件下培养，直至线虫发育至幼虫四期（L4期）。48小时后，向平板中加入M9缓冲液，使用巴斯德移液管收集L4期幼虫。将收集的幼虫转移至1.5毫升离心管中。

为三个实验组设计检测时间表。从每组中转移约100微升的线虫悬液至含有400微升5%卢戈氏碘液的1.5毫升微量离心管中。在混合器中轻轻振荡管子5分钟。

从混匀器上取下离心管后，静置使线虫依靠重力沉降。用一毫升 M9 缓冲液将线虫洗涤三次。将线虫重悬于 100 微升 M9 缓冲液中后，转移约 50 微升至载玻片上。

将盖玻片放置在载玻片上。接着，在体视显微镜下选择明场模式，观察线虫。保存每组至少包含10条线虫的图像，格式为jpeg文件。

最后，根据线虫的碘染色结果计算糖原含量。通过肉眼观察糖原含量检测发现，与喂食大肠杆菌OP50的线虫以及喂食大肠杆菌OP50加D-葡萄糖的线虫相比，饥饿处理的线虫染色较弱，其中喂食大肠杆菌OP50加D-葡萄糖的线虫表现出最强的染色强度。实验开始时，将500至1,000条L1期同步化的秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）转移至NGM琼脂平板上，并在20摄氏度下培养，直至实验当天。

为两个实验组设计实验时间表。使用M9缓冲液，在相应日期收集L4期和成虫期的线虫。将收集的线虫转移至1.5毫升微量离心管中，静置使线虫通过重力自然沉降。

用1毫升M9缓冲液清洗线虫三次，最后一次清洗后在离心管中保留约500微升。使用移液器，取10微升线虫悬液加入显微镜载玻片上，计算获得每微升含100条线虫所需的体积。在新的微量离心管中，加入相当于100条线虫所需的悬液体积以及100微升25%的赤藓红二钠盐溶液。

然后，加入 200 µL 大肠杆菌 OP50 培养物，并用 M9 缓冲液定容至 500 µL。将离心管置于摇床中避光振荡孵育 3 小时。孵育结束后，让线虫通过重力自然沉降，再用 1 mL M9 缓冲液洗涤数次，直至完全去除染色液。

最后一次洗涤后，将线虫重悬于 250 微升 M9 缓冲液中，并转移约 50 微升至载玻片上。盖上盖玻片，将载玻片置于 -20 摄氏度孵育 10 分钟，以麻痹线虫。在明场模式下使用体视显微镜，计数线虫的总数以及被染色的线虫总数。

肠道通透性检测显示，幼年线虫具有较强的肠道屏障，可防止染料泄漏。相比之下，老年线虫在整个体内出现染料外渗，表明肠道膜已受损。