可视化 秀丽隐杆线虫 使用亲脂性活体染料DiI观察角质层结构

本实验的总体目标是利用红色荧光脂溶性染料 dye eye，在透明的活体秀丽隐杆线虫中可视化角质层。首先制备用于染色的线虫群体，随后向群体中加入稀释后的 dye eye 染料，并使其孵育。

然后将动物从染色液中取出。经 Dai 染色后的角质层进行荧光成像，可显示其表面的精细结构，包括 Ailey 和 Ann 眼部生殖结构以及其他外部形态特征。与现有用于观察该透明生物角质层的方法（如直接成像、荧光成像、转基因表达、抗体染色、电子显微镜以及标记的小麦胚芽凝集素染色）相比，该技术的主要优势在于操作简便、相对快速、成本低廉，并且能够在活体动物中获得清晰美观的角质层结构分辨率。

该方法有助于解答多个领域中的关键科学问题，这些领域利用秀丽隐杆线虫模型系统及其角质层，研究内容包括细胞分泌与角质层结构、表皮细胞发育、异时性基因通路、先天免疫、形态性状的发育以及线虫的进化。本实验操作将由我实验室的研究生 Robbie Schultz 进行示范。在操作 D Eye 时，请注意其对光敏感。

始终用铝箔包裹 D 眼以避免光照。同时佩戴手套和实验服，因为 DMF 有毒，而 DAI 是一种致癌物。氰化物 Dai 毒性极强。

标准工作浓度为每毫升M九培养基中含有30微克DII，单个群体仅需400微升工作液。从一个60毫米的培养皿开始，皿内应含有无污染的线虫。用1.5毫升0.5%Triton X-100将线虫从培养皿中冲洗下来。

在M9缓冲液中，轻轻以环形动作摇动液体，使所有幼虫和成虫动物松散，然后将洗涤液转移至1.5毫升离心管中。立即以2000 RRP M离心30秒，使动物沉降至管底。尽可能多地弃去上清液，注意不要扰动沉淀的动物。

小心操作，不要贪多。用一毫升 M9 液体洗涤线虫，离心并去除上清液。

重复洗涤步骤。再次离心并弃去上清液。随后，向离心管中加入400微升含有30微克/毫升Dai的M9培养基。

轻轻涡旋离心管以重新悬浮动物。然后将离心管置于水平位置，在避光环境中于20摄氏度以350 RPM振荡3至16小时。上述步骤的时间控制至关重要。

首先，必须在Triton X去除dai结合的脂质之前将其彻底洗去。其次，需将动物在染料眼液中染色足够长的时间，以确保角质层被均匀染色。稍后，应将动物置于食物上恢复足够长的时间，以清除未结合的眼染料。

染色结束后，离心样品并去除染料溶液。用一毫升M9缓冲液洗涤样品。为去除未结合的染料，再次离心样品并弃去上清液。

将动物重悬于 400 微升 M9 缓冲液中，并转移至未接种细菌的 NGM 培养板区域。接种 OP50 大肠杆菌后，将动物置于避光环境中恢复至少 30 分钟，但不超过一天，因为在恢复期间染料荧光会逐渐减弱。动物应从染色液中爬出，迁移至食物区域。

这些动物更容易成像，因为其眼部游离染料的背景荧光较弱。首先在载玻片上制备琼脂垫，为确保所用琼脂垫厚度均匀，使用两个间隔物。

通过在载玻片上叠加两层实验室胶带制成间隔片。间隔片可无限次重复使用。接下来，将一张洁净的载玻片纵向放置在两个间隔片之间，用移液器加入约 150 µL 熔化的 4 倍浓度琼脂。

将熔化的AER滴加到洁净的玻璃载片中央。迅速用另一张载玻片垂直盖在熔化的AER及两侧垫片上，形成琼脂垫。小心地滑动移去盖片，使琼脂垫保持居中位于封片载玻片的顶部。

现在用移液器吸取5 µL线虫麻醉剂，滴加到载片上，将8至12只线虫放入麻醉剂中，并轻轻盖上显微镜盖玻片。使用配备至少40倍物镜和TRITC滤光片或其他兼容滤光片的复式显微镜或共聚焦显微镜观察线虫。该染料的激发波长最大值为549 nm，发射波长最大值为565 nm。

对于固定后的样本，成像部分是本实验方案中最具挑战性的环节。我们将展示如何制备样本以进行成像，但您必须接受过所使用复合显微镜或共聚焦显微镜的正规培训。我们发现，使用放大倍数至少为60倍的物镜，最有利于分辨染色方法所显示的细节。

本节中的每张图像均使用63倍物镜对秀丽隐杆线虫胚胎后发育阶段进行拍摄。角质层表面具有由环状沟槽分隔的年轮状结构，在某些发育阶段还可见称为ailey的纵向脊状结构。本节中的每张图像均使用63倍物镜对秀丽隐杆线虫胚胎后发育阶段进行拍摄。

角质层表面具有由环状沟槽分隔的年轮状结构，在某些发育阶段还具有称为脊纹（aley）的纵向脊状结构。每个发育阶段的角质层结构均具有独特的组成和形态特征，脊纹（aley）及Aly的脊状或沟槽结构均可被荧光染色，染色效果取决于表面组成。

在整个幼虫和成虫阶段，使用这种染料站立法后，它们在恢复后最长可达一天内仍保持可见。有时会观察到背景荧光颗粒，但并不常见。这是显示中等程度表皮结构缺陷的成年突变体动物的表皮。

艾利脊（Ailey ridges）不连续且为额外结构。艾利脊发生融合、分支或分叉，是一种常见的转基因标记。显性roll six等位基因会导致角质层扭曲，该现象可在艾利脊中观察到，并可能导致环纹排列不规则。

戴氏染色法还可染色其他外部角质层结构，包括成年雌雄同体的外阴以及成年雄性尾部的射精器和扇状结构。此外，戴氏染色法还能凸显外部形态中的细微缺陷，例如分叉的尾部或染色不足的情况。例如，染色两小时可能导致角质层染色不均，尽管暴露于环境中的神经元可能已被染色。一旦掌握该技术，若操作得当，整个过程可在四小时内完成（不包括成像时间）。观看本视频后，您应能充分理解如何使用戴氏染料对秀丽隐杆线虫进行染色，以观察其角质层及其他外部形态结构。