使用落射荧光显微镜和开源软件对秀丽隐杆线虫（C. elegans）胚胎进行成像

本方案展示了如何利用广泛可用的显微镜和开源软件，通过诺基DIC光学技术或荧光成像方法，对早期秀丽隐杆线虫胚胎中的动态事件进行成像。方案首先描述了如何解剖秀丽隐杆线虫胚胎并将其固定以进行成像。随后，回顾了DIC诺尔掩模光学系统的正确设置方法，以确保在最高细节水平下获得最佳图像。

还回顾了宽场落射荧光和照明的校准方法，以结合开源软件采集高质量的荧光图像数据。良好的显微技术能够可视化发育中胚胎的细胞动态。该方法的可视化演示至关重要，因为正确设置D iic光学系统较为困难，其术语可能令人困惑，且正确的操作技术难以通过书面形式准确描述。

此外，研究人员在进行荧光成像时应尽量减少光照暴露，以降低光毒性和光漂白。为准备成像用胚胎，首先配制两种封片溶液：一种为熔化的石蜡油，另一种为含2%至3%琼脂糖的缓冲液。

如果待成像的结构非常脆弱，可以通过小心避免沸腾来制备更致密的琼脂糖。两种储备溶液均在微波炉中融化，然后分装成每份四到五毫升的等分试样并储存。在成像当天，将一份凡士林溶液在65至70摄氏度的加热块中融化，并将一份琼脂糖溶液在微波炉中融化。

再次注意避免沸腾。随后，为保持溶液处于熔融状态，将其存放于加热金属块中。接下来，用一条实验室胶带覆盖两片载玻片的顶部和底部，并将一片洁净的载玻片置于这两片贴有胶带的载玻片之间。

现在将几滴熔化的琼脂糖滴加到干净的载玻片上，并用另一张干净的盖玻片覆盖。琼脂糖会铺展成一个薄的方形垫状，用于制备线虫垫。使用解剖显微镜和铂金丝挑取器，将两条成虫转移至18 mm × 18 mm盖玻片上含有9至12微升缓冲液的液滴中。

然后切割。用针或手术刀将线虫切开，使琼脂面朝下，释放出胚胎。将线虫垫放置在18 mm × 18 mm的盖玻片上，并用剃刀削去任何多余的琼脂。

最后，用画笔或牙签将熔化的凡士林溶液沿盖玻片边缘涂抹，以封固盖玻片。细胞现在已准备好进行成像。将玻片放置于显微镜上时，务必确保两个偏振器相互垂直对齐。

确保挡板和棱镜均不在光路中。若视野不暗，旋转聚光镜下方的偏振器直至视野变暗。使用10倍物镜找到胚胎。

在蠕虫体附近寻找成簇的幼胚，以便在成像视野内获得多个胚胎。为获得最佳图像，应避免选择位于蠕虫体内的胚胎。确定最佳胚胎后，切换至高倍物镜。

现在将滤光立方体切换至微分干涉差（DIC）模式。接着，将上方物镜的沃耳顿棱镜插入光路，并旋转聚光镜上的转盘，选择与物镜匹配的下方沃耳顿棱镜。棱镜就位后，调节此物镜转盘下方的滑块，使其与物镜的数值孔径相匹配。

为了获得最佳的科勒照明，需调节聚光镜，直至聚光镜光圈边缘呈现最清晰的状态。最清晰是指明暗交界处最为锐利或最聚焦的状态。为了获得最佳对比度，可通过旋转滑块上的旋钮来调节阿贝光阑和棱镜。

现在显微镜已基本准备就绪，可以使用计算机上的 Micro-Manager 和开源软件来调节其他成像参数。首先将相机增益设置为零。

然后将文件保存为8位，而非16位的TIFF格式。TIFF文件后续可使用Image J等开源软件进行分析。接下来，调整光照强度，使最亮的像素值略低于饱和水平。如果所有操作正确，图像将呈现三维效果，光线看起来如同从某一角度照射入内。

现在图像已非常清晰，选择需要成像的胚胎并绘制感兴趣区域。如果显微镜配有聚焦电机，请利用它在每个时间点采集多个焦平面。打开多维采集窗口，通过调节聚焦旋钮找到最上方和最下方仍有卵黄颗粒清晰对焦的焦平面，从而设定Z轴层扫的顶部和底部平面。

设置步进尺寸，这将决定采集的焦平面数量。现在，设置一个足够长的时间间隔，以完成所有焦平面的采集。

可将最长时间点设置得较高，以便软件持续采集图像直至手动停止。将软件设置为仅显示最后采集的图像，以便监控整个过程。现在为图像命名，并开始采集图像。

图像分析将在下一节末尾简要回顾。构建GFP视频的过程与制作四倍体或肌肉型DIC视频类似，但需使用包含荧光快门软件控制的配置文件。在确定胚胎位置后，确保上方沃尔斯顿棱镜不在光路中，并将滤光立方切换至F-I-T-C-G-F-P。

如果未在启动软件时自动设置，请确保相机增益设置为 255。图像文件应设置为 16 位 tiff 格式。现在关闭透射光源并点击实时成像。

调整紫外光源的强度和曝光时间，以获得良好的荧光信号信噪比，但应尽量减少光照暴露以保护细胞。接下来，设置时间间隔。根据之前所述的方法，确定时间点数量和焦平面数量后，开始进行图像采集。

为了分析影片，请使用开源软件。安装了 Micromanager 插件的 ImageJ 也可通过 loci 插件导入非常大的影片。这是一段使用诺玛斯基微分干涉差（DIC）光学系统拍摄的野生型胚胎影像。

后方位于右下角，腹侧位于左下角。该视频展示了每隔15秒采集的一系列单焦平面图像，播放速度为每秒14帧。

该胚胎在第一次胚胎分裂期间表达荧光，此处后端位于右上方。本视频展示了每10秒单个焦平面的变化情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用微分干涉差（DIC）Naski光学系统和落射荧光技术对活体胚胎进行成像，以研究动态事件。

希望您能更好地了解如何设置DIC诺马尔光学系统以获得最佳图像，并认识到使用落射荧光照明即可获取高质量的荧光数据，而不一定依赖更先进的显微镜。您还可以应用这些成像技术来观察缺乏特定基因功能的胚胎，从而进一步研究细胞分裂或发育过程中您所关注事件的遗传需求。