用于胰岛分离的猪胰腺手术灌注与分离

我们的实验室致力于胰岛细胞异种移植的微囊化研究。这需要可靠的胰岛分离与纯化技术。为应对这一挑战，我们通过在胰腺未受热缺血或机械损伤的情况下进行分离来获取胰腺。

这为实现有效消化和获得高产量的胰岛提供了策略。分离胰岛非常具有挑战性。胰岛的得率和纯度取决于整个流程中每个阶段的有效性和效率，从器官获取、消化到胰岛纯化均需精确操作。

此外，在规划动物实验操作时，伦理和人道考量至关重要，这有助于在实现最佳实验结果的同时减少动物所受的痛苦。因此，本文演示了如何通过经皮插管腹主动脉，实现对胰腺的选择性灌注。该技术可有效保存胰腺组织，进而分离胰岛。

因此，我们方案的一个主要优势是采用塞丁格技术进行主动脉插管。该技术有助于维持无血的手术视野，并保护解剖层次。通过使用更小的鞘管，该技术也可轻松适用于体型较小的猪。

本实验室目前正在研究建立胰岛细胞的按需供应方法。具体而言，我们感兴趣的是，将胰岛包封在水凝胶中是否能够延长其体外培养中的存活时间并改善其功能。最终目标是能够稳定分离猪胰岛，用于移植研究，甚至用于异种移植。

首先进行手术准备。为实施腹膜后解剖，使用电刀从右肾水平至腹主动脉分叉处，在中线右侧切开腹膜。锐性分离并暴露右肾、右肾静脉、右肾动脉、下腔静脉以及腹主动脉。

使用大血管环，对远端肾下腹主动脉进行环周控制。然后对中段肾下腔静脉（IVC）进行环周控制，并使用2-0丝线结扎IVC。接着，对左右肾动脉和肾静脉进行环周控制。

使用2-0丝线结扎这些结构。通过向下牵拉肝脏以暴露右侧膈肌，继续进行胸腔内解剖。在右侧膈肌的膜性部分施加两个艾利斯钳，并使用电灼在两个钳子之间切开膈肌。

将膈肌切口水平延伸至约七厘米。接着，游离并完全控制胸腔内下腔静脉。用一根2-0丝线环绕胸腔内下腔静脉打结，并用小止血钳夹住缝线两端，注意不要阻断下腔静脉血流。

然后使用两把艾利斯钳向下牵拉膈肌切口边缘，并将其延伸至左侧膈肌。通过外周静脉通路向猪体内给予全身性肝素以实现抗凝，并等待至少三分钟后继续操作。使用18号微穿刺针穿刺肾下腹主动脉。

然后将J型导丝经针穿入主动脉，并沿导丝撤出针头。沿导丝将10 French导管鞘置入主动脉，随后撤出导丝。接着，将静脉输液管连接至10 French导管鞘，以无菌操作方式通过导管鞘以每分钟40至60滴的速度灌注无菌UW溶液。

然后使用主动脉钳夹闭肾下主动脉和降胸主动脉。用先前放置的2-0线结扎胸腔内下腔静脉，并通过外周静脉通路注射氯化钾实施安乐死。随后通过定位胰管在十二指肠入口处的位置来分离胰管。

使用两根3-0丝线结扎导管，并在结扎线之间横断导管。完成胰腺切除术。为了将酶溶液灌注至胰腺，向胰管内注入60毫升的酶溶液推注剂，直至全部酶溶液灌注完毕。

将胰腺与网状滤器和橡胶垫圈一起放入Ricordi消化室中，并拧紧盖子以密封Ricordi消化室。然后将加热线圈置于设定为47摄氏度的热水浴中。将进液和出液套管插入含有500毫升1X HBSS的消化循环储液器中。

启动泵，以每分钟450毫升的流速运行，直至整个腔室充满消化液。随后，当液体在回路中循环时，将流速降低至每分钟100毫升。开始时，将泵设置为每分钟200毫升的流速，并将125毫升高密度梯度溶液加入连续梯度形成器，然后导入细胞处理器中。

将细胞处理器的离心功能设置为1000 rpm。释放系统中的空气，并用高密度梯度溶液重新引注。然后向梯度形成器中加入125毫升高密度梯度溶液和130毫升低密度溶液。

加入100毫升消化后的组织悬液。将细胞处理器速度提高至2000 rpm，持续3分钟。为准备收集纯化的胰岛组分，取16个50毫升锥形管，每管加入25毫升RPMI培养基，并按升序排列。

将纯化的胰岛组分收集到预先准备好的锥形管中。为了染色胰岛，从每份纯化的胰岛组分中取出100至200 µL等分试样，并在24孔组织培养板中使用DTZ染色法评估胰岛含量。

在4倍显微镜下使用明场显微镜检查每一份样品，其中胰岛呈现深红色至黑色。采用本方案，对三头猪进行了胰岛分离。明场图像显示了纯化的胰岛，并通过活/死染色法对胰岛的活力进行了表征。

胰岛分离后具有代表性的胰岛大小分布显示，胰岛直径主要分布在50至100微米范围内。此外，使用胰岛细胞计数仪评估了胰岛的得率和纯度，结果表明猪胰腺胰岛分离效率较高。