利用荧光cAMP差异检测器原位监测活细胞中cAMP的实时动态变化

我们的研究致力于解析细胞内周期蛋白激酶微区室的组织方式，重点阐明这些区室的形成与维持机制。我们旨在揭示使细胞能够在这些微区室内识别空间信号的关键组分，探索细胞对信号解读的差异性，并研究这些特性在哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等疾病状态下的改变。使用贝克曼载体对原代细胞进行感染具有较大挑战性。

为此，应针对不同类型的细胞优化实验条件，以实现cAMP生物传感器的充分表达。本方案可实现对活细胞内环磷酸腺苷（cAMP）动态变化的实时检测与监测，监测时间范围从数分钟至数小时。该生物传感器对cAMP具有高度特异性，因此本检测所产生的信号与细胞内cAMP水平直接相关，显著减少了其他细胞组分的潜在干扰，从而提供可靠的结果。

首先，获取人气道平滑肌（HASM）细胞培养物。使用移液管吸出并弃去培养瓶中的HASM细胞培养基。为洗涤细胞，加入5毫升预热至37摄氏度的无镁无钙杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS），轻轻倾斜培养瓶。

消化细胞时，加入3毫升0.25%胰蛋白酶EDTA，将细胞置于3至5分钟。加入含抗生素的新鲜培养基5毫升后，将细胞转移至15毫升离心管中，在200 ×g条件下离心5分钟。弃去上清液，沿管壁轻轻加入500微升不含镁和钙的DPBS。

吸除液体后，在显微镜下计数细胞，并将细胞密度调整至每毫升40,000个细胞。制备含有载体、试剂及所需数量细胞的主混合液。将500微升主混合液分装至每个35毫米培养皿的孔中，并进行孵育。

第二天，小心吸出每个孔中的培养基，加入450 µL含有镁和钙的DPBS，该溶液需预先预热至37°C。用铝箔纸包裹培养板，在37°C下孵育30分钟至1小时。在显微镜下观察细胞状态，并进行系列稀释，以制备用于药理学处理的100 µmol/L佛司可林和100 nmol/L异丙肾上腺素。

首先，培养经载体转染的人气道平滑肌（HASM）细胞。进行成像时，打开中央控制台和倒置荧光显微镜。启动指定软件，选择延时成像功能以进行记录。

将培养皿安装在显微镜载物台上。使用自动对焦和自动亮度功能，获取单个细胞的图像。调节黑平衡和激发波长。

然后点击自动对焦。找到一个含有多个细胞质荧光细胞的视野区域后，将时间间隔设置为每30秒拍摄一次，总时长为20分钟。然后点击确定，开始数据采集。

三分钟后，向相应的孔中轻柔加入 50 µL 药物，继续运行实验 17 分钟。打开实验过程中采集的图像文件。使用多边形或圆形工具，选择每个细胞的兴趣区域，并进行分析。

然后在 Excel 表格中打开分析后的数据，从添加药理学试剂前的一张图像开始，计算每张照片中每种条件下的平均亮度。在计算每种条件下每个平均值相对于初始荧光的荧光变化后，将数值导入统计分析软件，并以时间（秒）为横坐标，绘制 ΔF/F₀ 变化曲线。与对照组相比，在用 10 µM 福斯科林和 10 nM 异丙肾上腺素刺激 HASM 细胞后，随时间推移可观察到荧光强度明显下降。