从生肉中检测与分离Campylobacter spp.

本研究提供了一种快速且可靠的从食品中分离弯曲杆菌的方案。该方法克服了现有方法的多种缺陷，并为后续的分离物检测与表征提供了优势。在实际操作中，用于冲洗的辅助量通常比食品安全检测（如PCR）所用样品量大10,000倍。

有必要降低亚组抽样的误差，以确保结果能够代表目标群体。本方案已用于分离出50多种弯曲杆菌菌株，这些菌株随后被应用于基因组学研究。我们的数据和分析有助于深入理解弯曲杆菌与宿主相互作用及生产过程中的分子机制。

其规模之大促进了管理弯曲杆菌病的新型治疗策略的开发。本方案提供了将取样量减少13倍的机会，同时将从生肉中分离弯曲杆菌所需时间缩短24小时，或可在8小时工作日内完成。未来的研究可应用此方法不仅从食品样品中，还可从环境样品中分离弯曲杆菌。

这有助于消除假阴性结果，并更准确地定量受污染样本的数量。首先，从包装中取出450克鸡肉块，放入均质袋或滤袋中。向装有鸡肉的均质袋中加入200毫升0.1%缓冲蛋白胨水。

从胃部或袋子外部手动按摩或触压样品 2 分钟。使用电动移液器控制器，从袋子的滤过侧收集全部鸡肉冲洗液，并将其分配至无菌离心管中。然后在室温下以 10,000 G 离心 10 分钟。

使用电动移液器控制器和25毫升一次性塑料刻度移液管，小心收集上清液并弃去。为富集弯曲杆菌，向已灭菌的500毫升Bolton肉汤中加入25毫升陈旧马血。

将1瓶抗生素添加剂用5毫升50%乙醇重悬，然后将重悬后的抗生素添加剂加入Bolton肉汤中。接着，将沉淀物重悬于50毫升含有马血和抗生素的Bolton肉汤中。将样品置于密封容器内，容器中维持85%氮气、10%二氧化碳和5%氧气的气体混合环境。

将样品在 42 摄氏度下孵育 24 小时。首先，将布氏琼脂平板打开盖子后置于生物安全柜中干燥。将醋酸纤维素滤膜置于布氏琼脂平板中央。

用移液器将4滴弯曲杆菌增菌样本滴加到滤膜上，每滴20微升。滴加后，在室温下孵育15分钟，然后小心取出滤膜，将平板在42摄氏度下孵育约24小时。孵育结束后，挑取具有特定特征的典型弯曲杆菌菌落。

在布氏琼脂平板上划线分离菌落以进行纯化。对于长期保存，挑取在布氏琼脂平板上生长的空肠弯曲菌菌落，接种于Bolton液体培养基中。将样品置于密封容器内，容器中维持由85%氮气、10%二氧化碳和5%氧气组成的气体环境。

将样品在 42 摄氏度下孵育过夜。然后将 900 微升过夜培养的空肠弯曲菌（Campylobacter）培养物加入含有 100 微升 DMSO 的 2 毫升冻存管中。在干冰乙醇浴中迅速冷却 10 分钟，随后转移至 -80 摄氏度冰箱中保存。

不同孔径滤膜的比较结果显示，相较于0.45微米滤膜，更多细胞能够通过0.65微米滤膜。首先，取含有弯曲杆菌菌落的布鲁氏菌琼脂平板，将纯化的弯曲杆菌菌落分散至96孔板中，每孔加入100 µL裂解液。在热循环仪中于99 °C裂解样品10分钟，随后在20 °C冷却2分钟。

然后在室温下以 8,000 G 离心 10 分钟。准备 20 微升的反应体系，包含预混液、DNA 样本、内参扩增对照模板、引物和探针。将所有样本以每份三个复孔的方式加入 96 孔光学反应板中，并用光学膜密封，随后放入实时荧光定量 PCR 系统中。