血小板中超氧阴离子生成的替代检测方法

我们的研究旨在阐明活性氧的生成如何调控血小板功能并影响止血反应。在本研究中，可靠地检测关键活性氧——超氧阴离子至关重要。目前检测超氧阴离子最常用的技术是采用DCFDA作为荧光探针的流式细胞术。

这些方法存在局限性。它会诱导活性氧的释放，从而导致数据不可靠，且无法区分不同类型的活性氧，也不能对血小板中的活性氧进行定量。本视频介绍了两种用于检测血小板超氧阴离子的替代技术。

第一种技术利用DHE对活血小板进行染色，以快速动力学和单细胞分辨率检测超氧阴离子。第二种技术利用自旋探针CMH定量测定血小板生成超氧阴离子的速率。总体而言，本视频中介绍的技术相较于大多数现有方法具有显著优势，代表了我们在研究血小板氧化还原依赖性调控方面实验工具的重要进展。

首先，在改良的Tyrode缓冲液中配制适当的包被溶液，并将8孔显微载片在37°C下孵育2小时以完成包被。随后用改良的Tyrode缓冲液洗涤包被后的显微载片两次。将显微载片置于含有5 mg/mL BSA的改良Tyrode缓冲液中孵育至少30分钟，以阻断非特异性黏附。为制备洗涤后的血小板，将枸橼酸盐抗凝的全血在200 ×g下离心20分钟，以获得富血小板血浆。

然后向富血小板血浆中加入吲哚美辛和PGE1，在500 G条件下离心10分钟。将所得的血小板沉淀重悬于37 °C的改良Tyrode's HEPES缓冲液中，调整浓度至4 × 10⁷ 个血小板/mL。将分离的血小板在37 °C静置30分钟。接着，向血小板悬液中加入DHE溶液，使其终浓度为10 M，在37 °C孵育1分钟。

孵育后，从载玻片上移除封闭液，并将其置于显微镜载物台上进行成像。随后轻轻加入血小板。使用倒置共聚焦显微镜配备40倍油镜观察DHE向2-羟基乙啶的转化。

成像10分钟，每10秒采集一次图像。为监测激动剂诱导的超氧阴离子生成，在血小板加入后10分钟添加可溶性激动剂，并继续采集荧光图像10分钟。利用本方案，可研究血小板在黏附于胶原或纤维蛋白原过程中，以及黏附于多聚赖氨酸（PLL）后经凝血酶刺激时超氧自由基的生成情况。

首先，将经柠檬酸盐抗凝的全血在200 G条件下离心20分钟，获得富血小板血浆。向血浆中加入吲哚美辛和PGE1，然后在500 G条件下离心10分钟。将所得血小板沉淀重悬于改良的Tyrode's HEPES缓冲液中，于37 °C下调整浓度至2 × 10⁸ 血小板/mL。

将血小板在37 °C下静置30分钟。向血小板悬液中加入DETC，使其终浓度为5 µM，再加入去铁胺，使其终浓度为25 µM，随后加入CMH，使其终浓度为200 µM。将样品放入配有聚四氟乙烯涂层搅拌磁珠的聚集反应比色皿中，并置于聚集仪上。1分钟后，加入凝血酶或胶原等刺激物，孵育10分钟。孵育结束后，将血小板悬液从聚集比色皿转移至微量离心管中，迅速在6,000 ×g下离心10秒。

将50 µL上清液加入毛细管微量移液管中，并用EPR封口蜡密封。将样品转移至EPR扫描仪，并设置扫描仪参数。通过测定记录的EPR峰曲线下的面积，估算CMH氧化生成CM自由基的程度。

使用市售的CM自由基获得校准曲线。样品中的EPR信号强度与EPR峰的强度成正比。通过活性氧清除剂及选择性抑制超氧阴离子生成酶的抑制剂验证检测的特异性。

在存在选择性抑制剂 VAS2870 的情况下，血小板经凝血酶或胶原刺激的实验数据显示，NADPH 氧化酶是这两种激动剂诱导血小板产生超氧阴离子的主要来源。