一种用于筛选基因和组织特异性增强子的基于网络的分析流程

我们致力于破译非编码基因组，以理解基因如何在正确的时间和正确的位点被调控表达。我们利用基于网络的基因组学工具开发了易于使用的实验方案，使所有生物学家都能便捷地进行深入发现。多模态数据的广泛可及性有助于缩小增强子位置的范围，而通过开源网络界面可轻松访问这些数据。

这使得研究人员无需具备编程专业知识即可进行全面的增强子鉴定。本方案为任何没有增强子生物学背景的研究人员提供了基础，使其能够开始利用公开可用的数据集，检索目标基因的增强子。我们以在心脏生物学中具有重要作用的 TBX5 为例进行案例研究。

我们的工作流程鉴定了21个增强子，可能为心脏发育机制及先天性心脏病的研究提供线索。我们将结合包括空间基因组学在内的新数据来源扩展本方案，同时开发更多便于生物学家使用的工具。首先，打开 Ensembl 基因组浏览器。

选择与目标物种及版本匹配的基因组组装。在搜索框中输入目标基因，然后点击“Go”。在结果中，点击相应的 Ensembl 基因 ID。然后滚动至“Summary”部分，点击“Region in Detail”链接，以查看目标基因周围区域的可视化图谱。接下来，利用“Gene Legend”轨迹，搜索位于目标基因两侧的两个邻近基因。

这些基因以视觉元素的形式呈现，代表了GENCODE轨道中基本基因注释所包含的Ensembl与Havana注释的合并结果。通过观察基因名称旁的大于号或小于号来确定目标基因的方向性。点击并拖动光标跨越这些基因之间的基因间区域，然后在弹出框中点击“Jump to Region”以查看选定的区域。

通过点击轨道查看器顶部的“添加或移除轨道”来自定义显示。使用缩放和导航控件调整视图，以增强该区域的可视化效果。在“详细区域”标签查看器中，点击侧边栏中的“配置此页面”。

在“配置区域图像”侧边栏中，于“调控”部分下选择“按细胞或组织划分的活性”。使用细胞或组织搜索栏查找并选择所需的组织，或使用搜索栏下方的字母索引。单击与“细胞或组织”选项相邻的“实验”标签页。

选择 H3K4me1 和 H3K27ac 作为增强子的标志物，H3K4me3 作为启动子的标志物，然后点击“配置轨迹显示”。接着，选择“查看轨迹”，以可视化增强子检测区域内由 H3K4me1 标记的区域，以及目的基因上游由 H3K4me3 标记的区域。点击 H3K4me1 轨迹中的彩色可视化元素或方框，以获取在定义的检测区域内标记区域的基因组坐标。

这将打开“Hists and Pols”弹窗，显示该元件以碱基对表示的基因组位置。或者，通过在轨迹图上点击并拖动，以框选H3K4me1或H3K27ac轨迹下图表峰所在的区域，从而手动定义每个基因组特征的兴趣区域。然后将基因组位置坐标复制到文本文件中，并将文件保存为BED格式。

访问4DN数据门户。在主页上，确保将“实验集”选为堆叠柱状图的Y轴，“实验类型”选为X轴，并按生物体对图表进行分组。在X轴上找到原位Hi-C对应的柱状图部分，然后点击代表人类实验集的区段。

在弹出窗口中，点击“浏览”按钮，选择心肌成肌细胞以及我们关注的与心脏器官发生相关的基因 TBX5。然后，点击相应生物样本“标题”列中的链接，该样本对应于目标组织。接着，在“已处理文件”选项卡中，点击“探索数据”以更详细地查看 Hi-C 数据集。

输入在目标组织中鉴定出的启动子的坐标，然后右键点击热图以水平标记该区域。这些线条可实现启动子区域在热图上的可视化追踪。如有需要，可通过垂直拖动视图，直至搜索栏中Y坐标的上下边界与目标区域的边界对齐。

要删除任何不需要的线条，右键单击该线条并选择“水平”或“垂直标尺”，然后点击关闭系列。输入所有经实验验证的对照增强子的坐标，以基于其最小相互作用值计算相互作用阈值。使用预设视图，在Ensembl提供的启动子区域旁边显示文献中的三个对照增强子。

然后利用这些对照增强子，通过选择热图矩阵右侧颜色图例所示的最低非零相互作用得分，确定启动子-增强子的相互作用阈值。输入所有与H3K4me1相关的增强子区域的基因组坐标，并在Hi-C热图上垂直标记。通过将H3K4me3标记区域的相互作用得分与该阈值进行比较，过滤掉相互作用较弱的区域。

选择在热图上显示为更密集或颜色更深、且相互作用频率高于此阈值的基因组坐标区域，并以 BED 格式保存。在 VISTA 心脏增强子浏览器中鉴定出的四个心脏增强子中有三个（HS2329、mm1282 和 mm370）与基于网络的增强子检测方案所预测的区域重叠。增强子二则同时与增强子检测方案预测的区域以及一个经过实验验证的增强子区域重叠。

增强子16与预测的增强子区域以及先前的实验数据均显示出重叠。增强子Nine未与分析流程中预测的任何增强子区域重叠，但显示出部分H3K4me1信号富集。