体内应用REMOTE-控制系统调控内源性基因表达

本方法的重要意义在于其多功能性和高效性。该方法使研究人员能够以稳健的方式调控内源性基因表达，而这种调控在以往使用现有方法时难以实现。它使研究人员能够在不同表达水平以及时空特异性条件下研究基因的功能。

因此，该方法可用于检测表型的可逆性，在研究与疾病相关基因时具有重要意义。为实现基因抑制，将目标基因的内含子进行改造，使其包含含有12个对称Lac操纵序列的repron R元件。当LacIGY抑制蛋白在特定组织启动子驱动下表达时，目标基因即被抑制。

通过添加IPTG（LacIGY阻遏蛋白的拮抗剂），可逆转或调节目标基因的抑制状态，使其表达水平达到预期。为了实现上调表达，目标基因的启动子被改造为包含四个或更多个Tat操纵元件（T），作为rtTA-M2激活蛋白的结合位点。当在多西环素存在的情况下，由特定组织启动子驱动表达激活蛋白时，即可诱导目标基因的上调表达。

通过撤除或调整多西环素的浓度，可逆转或调节目标基因的上调表达至期望的表达水平。为了实现基因的抑制和激活，可将Lac阻遏系统与Tat激活系统结合使用。为了改造目的基因以实现抑制，应在目的基因的5'端附近鉴定出一个转录惰性的内含子，用于插入repron序列。

为了获取目的基因的基因组序列，请访问 UCSC 基因组浏览器，在“基因组”选项卡下选择最新版本的小鼠基因组草图。在搜索栏中输入目的基因的名称或符号，以查看该基因的转录本，然后点击“go”。接着，选择所需的目的基因转录本变体，并点击该转录本变体旁的基因符号。

接下来，在“序列及工具与数据库链接”横幅下方，点击基因组序列链接。在序列获取区域选项中，仅选择外显子、内含子以及每个基因对应的默认一条FASTA记录。在序列格式化选项中，选择将外显子显示为大写字母，其余部分为小写字母，并将重复序列用N掩蔽。然后，点击提交。

最后，将该序列保存到可进行注释的文档或程序中，并保留其大小写格式。为避免CpG岛中断，请在UCSC基因组浏览器的“表达与调控”栏下选择显示CpG岛轨迹，然后点击刷新。放大五端内含子区域后，点击每个以绿色显示的CpG岛，并选择查看此特征的DNA序列。

选择掩码重复至 N 后，点击获取 DNA 以获得 CpG 岛序列。最后，将这些序列与原始序列文件进行叠加，并将其注释为需要避免的内含子区域。为避免在目标组织中具有增强子特征的内含子区域，进入 ENCODE 数据库并选择实验图标。

在选择检测类型时，选择 ChiP-seq 或 DNase-seq，并根据拟进行基因工程改造的细胞类型填写其他类别。完成特征选择后，点击最左侧的蓝色图示，此时将显示“以列表形式查看结果”。随后，选择与拟改造细胞最匹配的 h3k4 单甲基化、h3k27 乙酰化、DNase 1 和 CTCF 的数据集。

在每个相关数据集中，滚动至文件部分，确认已选择 mm10 和 UCSC，然后点击可视化按钮。接着，在 UCSC 基因组浏览器中放大五端内含子区域，点击注释的峰轨道中的每一个峰。通过点击每个峰的染色体坐标，获取每个峰区域的 DNA 序列。

在视图下拉菜单中，选择 DNA，然后单击“将重复序列屏蔽为 N”。最后，将这些序列与原始序列文件进行叠加，并将这些区域注释为需要避开的内含子区域。为了在剩余的内含子区域中鉴定出具有高特异性和高预测效率得分的 sgRNA，请访问您选择的在线 sgRNA 设计工具（例如 CRISPOR）。输入目标内含子区域的序列，指定相关的参考基因组，并选择所需的前间隔序列邻近基序（PAM）。

然后，点击提交。接下来，根据预测的sgRNA特异性评分进行排序，并选择一个或多个同时具有较高预测效率评分的sgRNA。最后，设计一个DNA模板，其中包含两侧各带有60个碱基同源臂的PITT着陆平台序列，该同源臂对应于sgRNA的切割位点。

为了逆转目标基因的抑制，将适量的IPTG完全溶解于无菌蒸馏水中，配制当日即用于给携带特定修饰等位基因的纯合子小鼠提供含IPTG的饮水。用铝箔包裹水瓶，并将IPTG水溶液置于避光瓶中，给予相应基因型小鼠及对照组小鼠饮用，持续至少一周。随后进行目标组织中目的基因表达水平的分析。

为了诱导基因上调，需在饮食中给予多西环素持续一周，随后分析目标组织中目的基因的表达情况。qRT-PCR 分析显示，采用基于启动子的方法可使 DNMT1 表达水平抑制至未调控水平的 15%。通过以不同剂量的 IPTG 处理小鼠，该抑制作用呈剂量依赖性地得到逆转。

通过免疫染色在蛋白质水平验证了DNMT1的抑制作用以及IPTG处理对DNMT1抑制作用的逆转。对mKate2表达的qRT-PCR分析显示，基于内含子的方法通过减弱转录延伸，在转录起始位点下游数个千碱基处的操纵子位置实现了超过90%的抑制。在有或无LacIGY阻遏蛋白的小鼠小肠中mKate2表达的共聚焦图像验证了基于内含子的方法。

在含有经修饰的内源性 DNMT1 等位基因（带有 Tat 和 Lac 操纵序列）的胚胎干细胞中，实现了 DNMT1 表达的稳健上调和下调。两种调控均可通过 IPTG 和 Dox 处理完全逆转并诱导。在肝脏、脾脏和肾脏中均观察到 DNMT1 的显著上调。

然而，心脏中未观察到明显的上调现象，这提示DNMT1的细胞周期依赖性表达模式以及心脏中增殖细胞的稀少可能是导致该结果的原因。通过调控关键基因的表达来研究其在体内的功能，常常因致死效应而面临挑战。我们的方法使我们能够克服目标基因的致死表型，从而能够在体内研究其在肿瘤发生中的作用。

同样，这项技术将有助于研究其他难以分析的重要基因。