基于增强子的表达载体的AAV递送 在体 小鼠脑中
2022年3月31日
本方案描述了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的瞬时增强子报告基因检测方法。该检测可用于诱导由增强子驱动的基因表达 体内 在小鼠大脑中。
该方案具有重要意义，因为它不仅能够显示增强子序列是否可以驱动表达，还能显示其在机体特定部位中何处可以驱动表达。该方法快速高效，注射过程耗时不到10分钟，且在样本采集后仅需数天即可观察到报告基因是否表达及其表达位置。
开始克隆时，选择或设计一个报告基因载体。此处使用的载体将增强子候选序列插入到EGFP报告基因的3'非翻译区，该报告基因在hsp68最小启动子的调控下表达。为扩增目标序列并将其克隆至载体中，需设计PCR引物，并在引物的5'端添加适用于Gibson克隆的相应同源臂。
使用设计好的引物，从DNA样本中进行PCR扩增。根据所需克隆反应的数量，用Pac1和Asc1酶消化1至10微克的载体DNA。通过在100伏电压下进行0.7%至1%的凝胶电泳30至60分钟，分离限制性消化片段。
切下线性化载体的条带，并使用商业化的胶回收试剂盒进行纯化。在完成Gibson克隆和细胞转化后，将细胞涂布于选择性培养基上，在37摄氏度条件下过夜培养。在确认报告基因载体成功克隆后，使用甘油菌种接种5毫升的预培养液。
在30摄氏度、180转/分钟的摇床培养箱中培养8至16小时。当培养液变浑浊后，将种子培养物按1,000倍稀释于250至300毫升新鲜的选择性LB培养液中，并在30摄氏度、180转/分钟的摇床培养箱中过夜培养。使用商业质粒大提试剂盒纯化质粒。
为了检测ITR的重组，进行Xma1酶切消化。观察条带，确保酶切结果显示预期数量的条带。
重组将导致条带数量少于预期。准备用于递送的重组 AAV 混合物。若比较多种增强子报告病毒的表达模式，需将每种病毒稀释至其病毒滴度与浓度最低的病毒相等。
将增强子报告病毒与组成型表达的对照报告病毒按2:1或3:1的比例混合。加入少量快绿染料，终浓度为0.06%。用镊子轻轻将由微升级刻度毛细管拉制而成的玻璃微量移液管尖端刺入洁净无絮的擦拭纸中，使其尖端断裂。将该移液管插入抽吸装置组件中，该装置连接有压力施加设备，并配有橡胶垫圈以固定微毛细移液管。
通过吸液装置施加负压，将约 0.2 至 0.5 微升的矿物油吸入移液管中。将吸液装置组件放置一旁，待病毒溶液置于冰上直至准备注射。在对新生小鼠进行冷冻麻醉后，使用吸液装置组件施加负压，将病毒混合液吸入拉制的玻璃移液管中，直至弯月面超过 2 微升刻度线。
将小鼠从冷室中取出，放置在实验台面上。找到双侧注射位点，该位点位于人字缝与前囟中点处，且处于矢状缝与双眼之间。使用酒精棉片对注射部位进行消毒。
使用拉制的玻璃移液管刺穿新生小鼠的颅骨。当针头进入颅骨时，通过吸液装置施加正压。向侧脑室注入一微升病毒，并撤出移液管。
将小鼠置于加热垫或加热舱中使其恢复。待动物苏醒后，将其放回饲养笼。使用5倍物镜以低倍率记录横跨脑切片的荧光图像。
通过定位注射位点，根据红色荧光细胞的密度和强度评估病毒转导的范围。比较转导效果相似的动物。使用25倍以上的高倍物镜记录荧光图像。
接下来，打开分析软件，应用 3×3 中值滤波器以减少噪声。单击“Process”菜单，然后单击“Noise”，选择“Despeckle”选项。随后，为从图像中减去背景荧光，首先将多通道图像的各通道分离。
单击“图像”菜单，然后单击“颜色”，并选择“拆分通道”选项。使用矩形或圆形选区工具，在图像中无荧光细胞的区域绘制一个小形状。通过单击“分析”然后单击“测量”，测量背景的平均像素强度，并重复多次采样。
从五到八个背景区域取平均灰度值，并舍去小数部分。选择“Process”菜单，点击“Math”然后选择“Subtract”，将该背景值从图像中每个像素的数值中减去。接着输入要减去的背景值，点击“确定”。如有需要，选择“Image”菜单，点击“Color”，然后选择“Merge Channels”，将各通道重新合并为一个多通道图像。
为了计数绿色荧光细胞的数量，先隐藏绿色通道，然后使用自由选择工具在表达红色荧光的脑区周围绘制一个区域。点击“测量”功能，以测量所选区域内红色通道的面积、积分密度和平均灰度值。使用多点选择工具计数绿色细胞的数量，并将绿色细胞数量除以红色通道的积分强度进行归一化。
在出生后第0天（P0）将增强子报告基因通过颅内注射导入小鼠体内，携带阳性AAV构建体的小鼠在注射后28天显示出皮层中下层由增强子驱动的EGFP表达。而在P0注射阴性对照构建体的小鼠在注射后28天未显示任何EGFP表达，表明该增强子元件可在小鼠脑中驱动EGFP的转录。为了可视化成功转导的区域并控制潜在的变异性，检测了不同滴度的AAV递送增强子报告基因文库。
高滴度候选增强子文库在P7小鼠脑中驱动广泛的EGFP表达，而低滴度候选增强子文库则驱动稀疏的CGFP表达。每次注射时，必须将增强子报告AAV与阳性对照混合，以区分无活性的增强子与注射失败的情况。该方法可与免疫组织化学、RNA FISH或单细胞RNA测序相结合，以确定增强子在哪些细胞类型中具有活性。
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概述
本研究介绍了一种基于重组腺相关病毒（rAAV）的新型瞬时增强子-报告基因检测方法，可用于小鼠脑内的活体实验，以可视化增强子驱动的基因表达。该方案使研究人员能够快速评估某一增强子是否能够驱动基因表达，以及其在特定脑区中的表达位置。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 基因表达
- 分子生物学
背景
- 理解增强子序列对于破译基因调控机制至关重要。
- 体内模型可提供特定组织中基因表达模式的深入见解。
- 与传统方法相比，该方法能够快速评估基因活性。
研究目的
- 建立一种高效的检测方法，用于在活体生物中可视化增强子活性。
- 实现对小鼠大脑中报告基因表达的快速评估。
- 实现对增强子驱动表达的精确定位。
使用的方法
- 该方案采用基于rAAV的转导方法。
- 利用小鼠脑模型评估病毒递送后的表达模式。
- 关键步骤包括克隆报告基因载体以及进行体内注射。
- 注射后数天内即可分析基因表达模式。
主要结果
- 在特定皮层中成功可视化增强子驱动的EGFP表达。
- 能够清晰区分阳性与阴性对照构建体的作用效果。
- 表达模式的验证表明对增强子活性的评估有效。
结论
- 本方案展示了一种在体内评估增强子功能的新方法。
- 可实现对基因表达的快速且局部化的评估，有助于加深我们对调控机制的理解。
- 该方法对于未来探索神经环境中基因调控的研究具有重要价值。
常见问题
行业高管相关性
该方案能够在小鼠大脑中快速进行体内增强子活性评估，无需依赖转基因模型即可实现基因调控的空间和时间分辨率。通过将非编码DNA元件与疾病相关神经回路中的功能性表达模式相连接，本方法支持靶点验证。该技术通过提供基于成像的定量读数，加速了早期发现阶段的机制性风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过检测候选增强子序列是否能在特定脑区驱动基因表达，来验证治疗假设。
- 操作价值：利用标准克隆和腺相关病毒（AAV）包装技术，构建增强子-报告基因文库，用于对调控元件进行高通量筛选。
- 预测价值：通过将增强子活性与大脑皮层及其他神经结构中细胞类型特异性的表达模式相关联，实现生物学层面的风险预判。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：产生定量的荧光读数（EGFP 强度），与不同发育阶段增强子的强度和活性模式相关。
- 操作价值：利用不断扩展的腺相关病毒血清型和标准化成像流程，可在多种构建体中实现可重复、可扩展的增强子检测。
- 检测适用性：生成经过验证的生物系统（转导的小鼠脑组织），适用于免疫组织化学或单细胞 RNA 测序等下游应用，以确定增强子激活的细胞类型。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将增强子活性映射到特定皮层结构和发育时间点（P0 至 P7），支持与疾病相关的系统建模。
- 转化连续性：提供标准化且具有空间分辨率的表达数据，促进跨职能协作，助力生物标志物匹配和靶点筛选。
- 风险调控的进展评估：通过标准化的绿色至红色荧光比值，区分活性增强子与阴性对照，辅助决策推进或终止研究。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段，可在确定先导分子及进行临床前验证之前，用于对非编码调控元件进行假设检验。
- 发现生物学：通过可视化增强子在小鼠大脑中驱动表达的区域，将基因型与神经组织中的表型联系起来，支持通路解析。
- 筛选：通过标准化病毒生产、均一化的滴度以及与对照报告基因共注射，实现检测就绪，从而区分真正的增强子活性与递送失败。
- 分析：通过整合密度测量和背景扣除的荧光成像，实现增强子活性的定量比较。
- 转化研究：可通过后续进行RNA FISH或免疫组织化学分析，确定增强子驱动表达的细胞类型特异性，从而与临床前研究相衔接。
- 企业级复用：建立可重复使用的增强子文库筛选平台，利用低成本AAV生产和标准显微镜技术支持多次筛选项目。
运营与企业影响
- 科学价值：通过直接在体内可视化增强子功能，减少其功能的不确定性，从而提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：通过可控的病毒滴度、背景扣除方案和标准化的细胞计数，提升实验的可重复性与标准化水平。
- 战略价值：无需构建和维持转基因品系即可快速筛选增强子候选序列，从而提高资本使用效率。
- 项目组合影响：通过提供疾病相关脑区内增强子活性的清晰成像证据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备分子克隆技术经验，以进行Gibson组装和病毒载体的制备。
- 依赖腺相关病毒（AAV）纯化与滴定平台，以实现稳定可靠的增强子-报告基因递送。
- 需要掌握立体定位注射技术及新生小鼠操作技能，以实现精确的颅内递送。
- 依赖荧光显微镜及图像分析工具（如背景扣除、通道分离），以获得可靠的检测结果。
- 受限于增强子的上下文依赖性；其活性可能在不同发育阶段、脑区或疾病模型中存在差异。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:39
Enhancer Candidate Sequence Cloning into the AAV Vector Plasmid
3:09
Intracranially Inject rAAV-Packaged Plasmid into Neonatal Mice
5:32
Image and Analyze Brain Tissue Sections for Enhancer Activity
8:10
Results: AAV Deployment of Enhancer-Based Expression Constructs in Mouse Brain
9:21
Conclusion
