制备用于联合单核RNA测序与ATAC测序及整体代谢组学分析的非人灵长类胎儿胰岛冻存样本
2024年11月8日
本方案描述了从冷冻的非人灵长类动物胰岛中分离高质量细胞核的步骤，可用于进行单细胞核同时RNA测序和ATAC测序，同时保留同一标本中的大部分胞质组分，以用于代谢组学分析。
我们采用一种高度可转化的非人灵长类动物模型，评估妊娠期间母体饮食和药物摄入对子代胰岛胚胎发育及出生后功能的影响。发育过程中的程序性改变可能会改变个体日后对疾病的易感性。在处理诸如非人灵长类动物等难以获取的样本时，一个挑战是如何从同一个体中高效地评估多个科学问题。
由于检测试剂的不兼容性以及待定量分子对时间敏感的降解特性，同时从代谢组和基因组中提取信息往往较为困难。本方案允许从同一起始材料中推断出代谢物丰度、染色质可及性以及差异基因表达。这种多层次的方法有助于揭示代谢如何影响胰岛细胞基因组的机制。
首先，将分离的恒河猴胰岛组织在冰上解冻，向组织沉淀中加入 500 µL 的 0.1× 裂解缓冲液。使用一次性无 RNA 酶的研磨杵，在冰上轻轻匀浆组织 15 次。将样品在冰上孵育 10 分钟。
然后向匀浆液中加入 500 µL 洗涤缓冲液，冰上用移液器轻轻混匀。用 300 mL 洗涤缓冲液预润洗一个 30 µm 的预分离滤器，将 1 mL 细胞匀浆液过滤至一个 5 mL 离心管中。将过滤后的匀浆液在 4 °C 条件下，于摆桶离心机中以 500 ×g 离心 5 分钟。
使用移液器将一毫升上清液转移至冰上的冻存管中，并立即在 -80 摄氏度下冷冻，用于后续代谢组学实验。向细胞核沉淀物中逐滴加入一毫升洗涤缓冲液，以重悬沉淀。将洗涤后的沉淀物在 4 摄氏度下，以 1000 ×g 的离心力在水平转子离心机中离心五分钟。
重复洗涤后，将细胞核重悬于1毫升洗涤缓冲液中。用移液器在另一离心管中混合10 µL细胞核悬液与10 µL 0.4%台盼蓝溶液，然后将混合液加入自动细胞计数仪专用载玻片中。最后，使用细胞计数仪测定细胞核浓度。
测序实验获得了理想的完整细胞核。根据基因表达研究，获得了分离自胎儿非人灵长类动物胰岛中细胞亚型的UMAP聚类结果。利用胞质组分检测了胰岛代谢物的丰度，如二羟基丙酮磷酸、甘油-3-磷酸、2-氧代戊二酸、肌酸和谷胱甘肽。
概述
本方案概述了从冷冻的非人灵长类动物胰岛中分离高质量细胞核的方法，可用于同时进行RNA测序和ATAC测序。该方法还保留了大部分胞质组分，用于代谢组学分析，从而实现对代谢与基因组相互作用的全面理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物学
- 代谢组学
背景
- 非人灵长类动物模型对于研究人类疾病机制至关重要。
- 母体饮食和药物可影响子代胰岛的发育。
- 由于样本易降解，代谢组与基因组的同步分析具有挑战性。
- 本研究解决了从有限样本中进行高效多层次分析的需求。
研究目的
- 评估母体因素对胚胎胰岛发育的影响。
- 探讨代谢变化如何影响基因组表达。
- 建立一种可对同一样本进行全方位分析的实验方案。
使用的方法
- 从胰岛中分离细胞核。
- 同时进行RNA测序和ATAC测序。
- 保存胞质组分用于代谢组学研究。
- 多层次分析以评估代谢物丰度和基因表达水平。
主要结果
- 成功分离出高质量的细胞核和胞质组分。
- 揭示了母体饮食对胰岛功能的影响机制。
- 证明了基因组学与代谢组学同步分析的可行性。
- 揭示了胰岛中代谢与基因表达之间的潜在关联。
结论
- 本方案可实现对胰岛的全面分析。
- 研究结果可为未来关于疾病易感性的研究提供参考。
- 强调了母体因素对子代健康的重要性。
常见问题
行业重要性概述
整合来自冷冻非人灵长类动物胰岛的单核RNA测序（snRNA-seq）、ATAC测序（ATAC-seq）以及群体代谢组学数据，可解决利用稀有或珍贵样本进行多组学研究的关键瓶颈问题。该方法能够从有限的样本材料中实现全面的分子特征分析，有助于提高早期靶点验证的预测可信度，并降低机制研究中的风险。本实验方案最大限度地提高了每个样本的数据产出，为代谢性疾病和发育性疾病研究中的风险调整型项目组合决策提供依据。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够在与疾病相关的系统中探究细胞身份背后的代谢和表观遗传机制。
- 通过将代谢物丰度与基因表达及染色质可及性关联，支持功能靶点的验证。
- 通过整合来自同一生物来源的多层面分子数据，有助于实现机制层面的风险评估。
筛选与检测方法开发
- 为下游高通量测序和代谢组学工作流程制备经过验证的细胞核和细胞质组分。
- 通过减少多队列研究中的批次效应，提高检测的可重复性和标准化水平。
- 实现定量的多组学输出，用于对化合物或扰动效应进行可靠评估。
转化与临床前研究
- 在转化模型中将分子读数与疾病相关的代谢和表观遗传生物标志物进行关联。
- 利用非人灵长类系统，支持从发现到临床前验证的连续性研究。
- 提供关于发育编程及疾病易感性机制的预测性见解。
流程与工作流整合
本方案通过实现对稀有组织样本的多组学分析，连接了早期发现、靶点验证和转化研究。
- 发现生物学：支持在胰岛发育过程中对代谢-表观遗传相互作用的假设验证。
- 筛选：提供可重复的细胞核和代谢物制备方法，适用于可扩展的组学检测。
- 分析：提供定量的基因表达、染色质可及性和代谢物丰度数据，用于比较分析。
- 转化研究：在非人灵长类动物模型中将分子发现与疾病相关表型相联系。
- 企业级复用：建立可重复使用的流程，以从有限或存档样本中最大化提取数据。
运营与企业影响
- 科学价值：提高早期研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化多组学样本制备流程，最大限度减少批次效应。
- 战略价值：支持更科学的立项/终止决策，更高效地利用稀有样本资源。
- 项目组合影响：支持对代谢性疾病和发育性疾病项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞核分离、单细胞核测序和代谢组学实验流程方面的专业知识。
- 需要具备高通量测序和质谱分析基础设施的使用权限。
- 需要严格进行跨团队标准化操作，以控制批次效应。
- 可适用于其他类型的组织，但可能需要针对不同样本基质优化实验方案。
- 样本稀缺性和对降解的高敏感性在通量和时间安排上带来了实际限制。
