用于研究缺血性脑卒中亚急性期和慢性期转导细胞中 Neurod1 异位表达的 AAV 系统与小鼠模型

我们正在探索利用腺相关病毒（AAV）介导的神经源性转录因子异位表达作为缺血性脑卒中的一种潜在治疗方法。我们的研究重点是观察在脑卒中后的亚急性期和慢性期，在表达GFAP的细胞中表达Neurod1是否能够增加被转导的神经元数量，并与运动功能的改善相关。近期研究发现，使用相同的AAV，皮层中基因表达因脑区不同而存在差异。我们的研究发现，与运动皮层相比，GFAP启动子在内侧前额叶皮层中活性更高，表明被转导的细胞对特定启动子的响应存在差异。

因此，涉及神经发生相关转录因子的治疗应根据靶向脑区进行个性化设计。目前的挑战包括由于ET-1注射速率以及不同脑区间转导效率的差异所导致的脑卒中病灶大小的变异性。不同脑区及小鼠品系间的AAV滴度和嗜性差异可能影响转导效率，从而影响脑卒中后异位Neurod1表达的细胞水平评估。

将星形胶质细胞转化为神经元的主要挑战在于区分重编程产生的神经元与预先存在的神经元。我们实验室致力于开发新型工具，以验证此类重编程过程在体内发生。最终，我们希望阐明异位表达神经元转录因子如何促进脑损伤动物的恢复。

首先，将麻醉后的动物从麻醉舱中取出，并放置于清洁的表面上。清洁小鼠手术区域后，将其鼻部放入立体定位仪的鼻夹中，并使用耳杆固定颅骨。使用10号手术刀片，从眼睛中点后方开始，沿矢状面平行方向向顶骨做一垂直切口。

然后，轻轻牵拉皮肤以暴露颅骨。接着，使用棉签去除颅骨上的筋膜，并使颅骨干燥，以充分暴露前囟。使用高速立体定位钻，在右侧感觉运动皮层的相应坐标位置钻出三个颅骨孔。

然后，将钻头更换为带有长度为0.375英寸针头的26号注射器。将1.5 µL浓度为400 µmol/L的内皮素-1溶液（溶于无菌PBS中）吸入注射器内。释放少量内皮素-1，观察针尖处是否形成液滴，以确保液体流动顺畅。

将针头尖端穿过颅骨，插入中间的钻孔中，但不得刺破硬脑膜。对齐后，将针头向下推进1毫米进入脑组织。使用哈密尔顿注射器，每次注入0.1微升，每次注射后等待一分钟，再进行下一次0.1微升的注射。

为防止注射间期及注射后针头堵塞，可释放少量内皮素-1，直至针尖出现液滴。使用无菌棉签在注射前擦去多余的内皮素-1。最后，使用4-0无菌缝线缝合颅骨上方的皮肤以关闭伤口。

麻醉内皮素-1处理的小鼠后，将其转移至立体定位仪。使用手术剪刀剪开伤口处的缝线。用镊子去除痂皮并拉开皮肤以暴露颅骨。

然后，使用无菌棉签干燥颅骨表面并定位钻孔位置。设置立体定位仪的操纵臂，安装一个针持器，针持器上装有一支26号、针头长度为0.375英寸的注射器。

现在，将 3.4 微升 AAV 溶液加入注射器中。将针头尖端穿过颅骨，插入第一个也是最靠前的钻孔中。确保针头不刺破硬脑膜，然后将针头向下推进至脑组织内 1 毫米处。

使用 Hamilton 注射器，按照之前演示的方法，每次推出 0.1 微升，共注射 1 微升 AAV 溶液。然后使用 4-0 Polysorb 聚酯缝合线缝合颅骨上方的皮肤以闭合伤口。将小鼠从立体定位仪上取下，转移至恢复区中洁净且预先加热的动物饲养笼内。