一种用于研究轴突变性及白质神经生物学的多功能小鼠皮层下白质卒中模型

本实验的总体目标是准确定位小鼠白质中的小梗死灶，以模拟这种常见的皮质下白质梗死类型。该方法有助于回答脑卒中研究领域中的关键问题，例如轴突损伤机制、神经元对皮质下脑卒中的反应，以及白质中各类细胞成分在脑卒中急性期和修复期的响应方式。该技术的主要优势在于能够精确地将脑卒中病灶定位至白质区域，并且可与多种小鼠模型联合使用。

通常，初次使用该方法的研究人员会遇到困难，因为白质体积较小，容易导致脑卒中定位错误。可能需要针对每种小鼠品系或立体定位装置对注射角度或立体定位坐标进行微调。首先，将拉制的玻璃移液管固定到连接真空管线的管路上。

将拉制好的末端插入 L-Nio 溶液中，或含荧光示踪剂的 L-Nio 溶液中。启动真空装置，施加负压，直至移液管直径为 0.5 毫米的部分至少有 2 毫米长度被液体填充。将已填充的移液管放置一旁备用。

然后将小鼠放入配备立体定位显微镜的立体定位仪中。根据批准的实验操作规程对小鼠实施麻醉并进行术前准备后，通过夹捏脚趾检查麻醉深度，小鼠应无任何反应。

接下来，将注射臂调整至36度。将拉制的玻璃毛细管固定器连接到低体积压力注射系统的远端，并将其安装到注射臂上。作1.5厘米长的正中头皮切口以暴露颅骨后，用棉签将颅骨表面擦干。

然后，在体视显微镜下以1至3倍放大倍数观察，使用微点工具去除覆盖的骨膜组织。用细尖标记笔标记前囟。接着使用配备精细钻头的外科钻，在前囟后方开始，沿中线左侧向前延伸，钻出一个直径2毫米的椭圆形颅骨开窗。

去除骨碎片和覆盖的软组织，以便观察大脑皮层。通过间歇性滴加无菌生理盐水保持皮层表面湿润。接着，将装有液体的移液管固定到注射器臂上。

将移液管的远端与前囟对齐，并将立体定位坐标归零。根据表一中列出的前部、后部以及内侧-外侧坐标，将移液管推进至第一个注射点。然后将移液管推进至皮层表面，并将背侧-腹侧测量值归零。

缓慢将移液管降至背腹向坐标。确保体视显微镜的放大倍数设置为3倍，并能清晰观察到校准的目镜刻度。从侧面观察倾斜的移液管，使气液弯月面呈矢状面视图。

液面弯月面应同时在移液管内壁和外壁的同一焦平面上清晰可见。现在，使用局部压力注射系统，设置为20 PSI，以20毫秒的脉冲注射100纳升L-Nio至脑内。注射完全部体积后，等待五分钟，以防止液体沿移液管轨迹反流。

然后，撤出移液管，并根据表一提供的第二组和第三组坐标重复注射操作。最后一次注射完成后，移除移液管，并用足量骨蜡填充颅骨开孔部位。最后，对合头皮切口边缘，并使用皮肤黏合剂固定。

给予术后镇痛后，将动物置于清洁的笼子中。在饮水中提供术后抗生素，持续五天，或直至处死动物时为止（若时间少于五天）。按照批准的程序处死并断头后，使用无菌剪刀从后方切开颅骨，然后用刮匙轻轻移除覆盖的颅骨。

接下来，将一支无菌的4毫米刮铲插入脑组织前部，以切断嗅球和视神经。然后，轻轻将脑组织从颅骨中取出，并置于冰上预冷的解剖缓冲液中。使用脑组织切块模具和无菌剃刀片，切取包含病变区域的2至3毫米厚的脑片，并将其放入冷的解剖缓冲液中。

在解剖显微镜下，辨认注射侧半球运动皮层下方的白质。在卒中后较早的时间点，将L-Nio与常用的实验室染料（如快绿）混合注射，可实现对梗死区域的可视化识别。在卒中后较晚的时间点，该区域可通过局灶性坏死和髓鞘苍白进行视觉辨认。

确定后，使用解剖刀小心地分离包含脑卒中区域的白质。根据需要去除上层皮层和下层纹状体。如图所示，采用内侧入路方法，在脑卒中发生七天后，通过红色显示的神经丝免疫荧光标记，可显示轴突丢失的程度。

采用后方斜向入路，脑白质缺血性卒中病灶位于侧脑室上方，通过IBA-1免疫标记检测可见显著的小胶质细胞活化反应。两种星形胶质细胞中间丝标记物——红色显示的波形蛋白（vimentin）和绿色显示的胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein）——揭示了卒中后白质星形胶质细胞的形态学改变。在诱导卒中时共注射荧光标记的葡聚糖胺，可识别出轴突因卒中而受损的单个神经元。

大部分标记出现在覆盖卒中区域的初级感觉运动皮层第五层和第六层神经元的轴突中。此图像为卒中后七天的结果。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在45分钟内完成。

观看本视频后，您应能充分掌握如何在小鼠中诱导局灶性白质脑卒中，并为多种后续处理步骤做好脑组织准备，从而有助于回答脑卒中及神经修复领域的重要科学问题。