基于高通量定量发光报告系统的DNA双链断裂修复活性评估

Artios 正在开发靶向 DNA 损伤反应的新型抗癌药物。为此，我们开发了一系列新型检测方法，用于测量细胞的 DNA 修复活性。这些检测方法对我们的研发项目产生了重大影响，推动了针对具有高度未满足医疗需求患者的临床阶段候选药物的测试。

准确测量靶向细胞活性对于推进新型靶向治疗药物的研发至关重要。无论是需要高通量、强信号-噪声比、快速周转时间，还是理想情况下能在不同生物系统间转移，开发具有这些特性的DNA修复因子检测方法一直具有挑战性。我们已开发出一系列基于发光信号的定量、可滴定且稳健的报告基因检测方法，用于评估四种主要双链断裂修复通路的功能效率：同源重组、非同源末端连接、微同源介导的末端连接以及单链退火。

这些报告基因检测已被验证可用于检测依赖信号通路的修复过程，对药物调控具有敏感性，且周转时间短。我们开发的修复底物为染色体外元件，因此可瞬时转染至目标模型中，并易于扩展为高通量形式。我们认为，我们的检测系统不仅在促进DNA损伤应答（DDR）药物发现方面具有重要意义，同时也有助于更广泛地加深对DDR生物学机制的理解。

在这方面，我们希望这些方法有助于加快新药物靶点的鉴定和开发，从而为癌症等存在重大未满足医疗需求的疾病带来治疗药物。首先，制备每种报告分子底物，并使用分光光度计检测其浓度。获取200纳克的报告分子底物。

将每种报告分子底物与高分子量DNA标记物一同在含有荧光双链DNA染料的0.7%琼脂糖TAE凝胶中进行电泳。验证每种报告分子底物均出现预期大小的清晰条带。若需评估化合物对报告基因检测的影响，将溶于相应溶剂的化合物加入96孔板的各孔中。

为96孔板制备转染混合物时，将萤光素酶对照质粒和NanoLuc双链断裂修复报告基因底物加入500微升转染缓冲液中，在1.5毫升离心管中混匀。加入脂质体转染试剂后，短暂涡旋DNA混合物，并于室温孵育10分钟。收集细胞时，用胰蛋白酶消化后重悬于含10%胎牛血清（FBS）的新鲜培养基中。

然后，测定细胞数量，并在新的15毫升离心管中，用含FBS的8.5毫升培养基重悬三次，每次细胞数量为10的6次方。将DNA转染混合物加入细胞悬液中，轻轻颠倒离心管数次以混匀。每孔接种80微升细胞悬液，将96孔板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养24小时。

根据制造商说明书配制对照荧光素酶和报告荧光素酶试剂。按1:100的比例将底物加入适量的检测缓冲液中并混匀。待酶标板和试剂恢复至室温后，每孔加入80微升对照萤火虫荧光素酶试剂。

将培养板置于摇床上，以每分钟450转的速度振荡3分钟。将培养板放入发光检测仪中，测定对照荧光素酶的发光信号。为测定报告荧光素酶信号，每孔加入80 µL NanoLuc报告荧光素酶试剂。

在450转/分钟的摇床中孵育3分钟后，将酶标板在室温下静置7分钟。最后，在化学发光酶标仪中检测报告基因荧光素酶的发光信号。对组分NanoLuc和萤火虫荧光素酶发光信号的评估显示，所观察到的修复缺陷是由NanoLuc信号降低所致，而萤火虫对照信号未受影响。