雷帕霉素调控的酪氨酸磷酸酶的开发与应用

我们的研究重点是开发能够调控酪氨酸磷酸酶活性的工具。我们已将雷帕霉素调控系统应用于多种磷酸酶，并证明该系统可对目标蛋白实现特异性和时间依赖性的调控。我们的目标是确定SHIP-2磷酸酶激活所诱导的形态学变化。

RapR 工具使我们能够确定磷酸酶激活在细胞中的瞬时效应，并揭示了参与细胞铺展和迁移的磷酸酶所介导的复杂且特异性的下游效应。此外，我们还确定了同一磷酸酶由结构域驱动的行为特征。这些发现增进了我们对磷酸酶在调控细胞形态光动力学及下游信号传导机制方面的理解。

我们的 RapR 工具能够对目标磷酸酶进行特异且时间可控的调控。将 iFKBP 结构域插入磷酸酶后，其可作为别构开关，在与雷帕霉素结合后恢复磷酸酶的活性，起到“开启”作用。我们还可以利用雷帕霉素调控系统重建信号复合物。

我们利用RapR工具的研究结果为确定SHIP-2相互作用组对其调控细胞活性能力的影响打开了新的途径。我们发现SHIP-2的SH2结构域结合在细胞回缩过程中至关重要。通过使用RapR工具，我们可以进一步探究哪些结合伴侣分子可能介导了这一调控作用。

首先，获取 HEK-293T 细胞。在六孔组织培养板中，每孔接种 800,000 个细胞，使用添加补剂的 DMEM 培养基。将培养板置于 37°C、5% CO₂ 条件下孵育过夜，以达到 60% 至 80% 的融合度。

接下来，将每份血浆DNA各一微克与200微升无血清DMEM培养基及六微升转染试剂混合。室温孵育15分钟后，将100微升转染混合物加入细胞培养板的每个孔中。在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中孵育过夜。

第3天，向细胞中分别加入适量的雷帕霉素或乙醇，在37摄氏度、5%二氧化碳培养箱中孵育1小时。随后将培养板置于冰上，用3毫升预冷的PBS轻柔洗涤细胞。吸除PBS后，加入300微升含有雷帕霉素或乙醇的裂解缓冲液，用细胞刮棒轻轻刮取细胞。

将样品转移至1.5毫升离心管中，在4°C、1,000 g条件下进行微量离心10分钟。为检测表达水平，取20微升上清液分装至新的1.5毫升离心管中。在95至100°C条件下，将样品与含5%β-巯基乙醇的20微升2×Laemmli缓冲液孵育5分钟。

首先，培养并制备表达RapR-Shp2的HEK-293T细胞用于免疫沉淀。在准备Sepharose时，将重悬的蛋白G Sepharose加入一个1.5毫升离心管中。加入裂解缓冲液后，在2,000 ×g条件下用微量离心机离心1分钟，并小心移除裂解缓冲液。

然后通过轻轻倒置离心管数次，将 Sepharose 重悬于 380 微升裂解缓冲液中。将 Sepharose 与 BSA 及抗体在 4 摄氏度下于旋转仪上孵育 1.5 小时。按照之前演示的方法洗涤 Sepharose 后，使用剪去尖端的吸头小心地将其重新悬浮于裂解缓冲液中。

取表达RapR-Shp2的HEK-293T细胞的上清液，加入到新1.5毫升离心管中悬浮的50微升Sepharose中，置于旋转仪上，4摄氏度孵育1.5至2小时。首先，获取表达RapR-Shp2的HEK-293T细胞，并使用蛋白G Sepharose进行免疫沉淀。免疫沉淀后，先用0.5毫升裂解缓冲液洗涤Sepharose两次，每次0.5毫升，再用0.5毫升洗涤缓冲液洗涤两次。

最后一次离心后，尽可能吸除上清缓冲液。然后向每个样品中加入40 µL磷酸化paxillin咪唑缓冲液混合物，可加入或不加入1 µmol/L雷帕霉素。轻轻弹动离心管混匀，立即放入32 °C的恒温振荡器中孵育40分钟。

将加热振荡器设置为每分钟 1,000 转，以确保样品充分振荡。为终止反应，向每个样品中加入 40 微升 2x Laemmli 缓冲液，并在 95 至 100 摄氏度下孵育五分钟。待样品冷却后，将每个样品取 15 微升上样至 4 至 15% 的梯度 SDS 聚丙烯酰胺凝胶中。

使用PVDF膜进行标准的Western印迹实验。最后，用抗FLAG抗体检测RapR-Shp2构建体，并用抗磷酸化paxillin抗体检测样品中磷酸化的paxillin。活性RapR-Shp2未显示磷酸化paxillin，与组成型活性Shp2相似，表明其保留了完整的活性。

无活性的RapR-Shp2与显性负性Shp2表现出相似的磷酸化paxillin水平，表明在失活状态下无活性。