一种用于研究雷帕霉素/mTOR 相互作用的半定量药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）实验

药物亲和反应靶标稳定性（DARTS）是一种用于检测新型小分子蛋白靶点的可靠方法。该方法可用于验证已知的小分子-蛋白相互作用，并发现天然产物的潜在蛋白靶点。在本研究中，我们通过监测蛋白稳定性变化并估算蛋白-配体相互作用的亲和力，进一步增强了DARTS实验的数据分析能力。

蛋白质-配体相互作用可绘制为两条曲线：蛋白水解曲线和剂量依赖性曲线。我们以mTOR与雷帕霉素的相互作用为例，建立本实验方案。使用含10%胎牛血清、2毫摩尔谷氨酰胺和1%抗生素的DMEM培养293T细胞。

将培养物在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。当细胞培养达到80%至90%融合度时，用预冷的PBS洗涤细胞两次。使用细胞刮刀将细胞收集到适量的预冷细胞裂解缓冲液中，并将正在裂解的细胞转移至1.5毫升离心管中。

颠倒混匀裂解缓冲液与裂解的细胞，置于冰上孵育10分钟。在4°C条件下，以18,000 ×g离心10分钟。将上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并保持在冰上冷却。

采用BCA法测定裂解液的蛋白浓度，并根据蛋白浓度计算蛋白酶的稀释比例。首先，将裂解液分别转移至两支1.5毫升离心管中，每管99微升。向每份裂解液中加入1微升小分子储备溶液，随后将两支离心管在室温下振荡孵育30至60分钟。

在冰上，用1x TNC对新鲜解冻的蛋白酶溶液进行系列稀释。小分子孵育后，将每份等分试样分装到五个管中，每管20微升。为确保消化时间一致，每隔30秒按特定时间间隔向各样品中分别加入2微升配制好的蛋白酶溶液。

对于一个对照组，加入 2 µL 的 TNC 缓冲液。在 5 到 20 分钟后，以 30 秒为间隔，向六个试管中分别加入 2 µL 冷的 20× 蛋白酶抑制剂混合液以终止消化反应。充分混匀后，冰上孵育 10 分钟。

将每个样品与六微升5x SDS-PAGE上样缓冲液混合并稀释，然后在70摄氏度水浴中煮沸10分钟。接下来进行Western blot实验：将等量的蛋白质样品与合适的分子量标记物一起加入8% SDS-PAGE凝胶的加样孔中。以80伏电压电泳30分钟，随后将电压调至120伏，继续电泳一至两小时。

验证小分子能否直接结合潜在靶标蛋白。在本方案中，通过与小分子孵育确认了对蛋白酶解的保护作用。与对照溶剂相比，雷帕霉素孵育后发现三条条带受到保护。

Western blot 结果显示，在低木瓜蛋白酶与蛋白比例下可检测到 mTOR 蛋白的存在，随着比例的增加，mTOR 蛋白逐渐减少并最终消失。mTOR 蛋白被木瓜蛋白酶降解的过程明显受到雷帕霉素存在的抑制，加入雷帕霉素后，蛋白水解曲线出现显著偏移。雷帕霉素以剂量依赖方式提高了 mTOR 蛋白水平，提示雷帕霉素处理增强了 mTOR 蛋白的稳定性。

对目标蛋白条带强度的定量分析表明，mTOR 是雷帕霉素的作用靶蛋白。为了获得最佳的逐步效应，本实验可能需要重复多次，以得到合适的蛋白酶与蛋白比例范围。