设定外泌体分离的成功分选条件

因此，我们研究的主要重点是研究间充质基质细胞及其分泌的细胞外囊泡在组织再生中的作用。我们研究面临的一个问题和目标是将无细胞疗法与细胞治疗相结合，推进其临床应用。表征分析至关重要，而目前要获得高纯度的囊泡以进行深入表征仍然非常困难，因为尚无能够实现高纯度分离的标准操作流程。

因此，我们希望采用细胞分选技术来研究、表征并最终将这种基于细胞外囊泡的新方法转化为临床实践。我们的方案包括四个部分：样本制备、细胞外囊泡表征、分选以及分选后分析。我们将重点介绍分选部分。如您所见，部分操作将在分选仪软件上进行，另一些则在触摸屏上完成。

与其它细胞外囊泡（EV）分离方法相比，我们的方案具有显著优势。首先，在35 psi压力下使用70微米喷嘴可保持EV分选后的完整性。其次，能够分离特定的EV亚群。最后，仪器支持保存分选参数设置，从而确保实验过程的可重复性。

在我们的实验室中，我们致力于开发用于细胞外囊泡分析的新型多色检测方案。特别是，我们专注于仪器设置以及荧光染料的研究。我们相信，能够识别并分离出稀有的囊泡亚群，将有助于更精确地表征这些囊泡，并推动对其在生物过程中作用的深入研究。

首先，打开细胞分选仪的压力管路和真空系统。开启仪器，打开生物安全柜，并启动分选软件。对流体系统加压，然后开启流体系统。

启动液滴驱动，使喷嘴中的压电晶体振动，从而产生液滴。执行去气泡程序，以消除系统中的气泡。随后，在高差压条件下运行5毫升离心管的清洗液5分钟，接着用5毫升去离子水运行5分钟。

执行手动启动程序时，请转至激光控制选项卡并开启激光电源。检查液流的垂直对准情况。为确定激光光斑位置，请按下激光液流拦截选项卡。

单击绿色箭头按钮，然后按照触摸屏显示器上的说明操作。初始化 IntelliSort，设置液滴驱动频率以及默认振幅值，以使液流形成液滴。对于精细激光校准步骤，将装有 5 毫升 QC 校准微球的试管放入进样器中，并运行 QC 校准程序。

在精细校准选项卡中，选择 X 轴和 Y 轴上的理想参数，以观察紧密聚集且准直良好的微珠。手动校准确认无误后，使用直径为三微米的质控微珠执行自动质控。将质控采集结果保存至软件校准协议中。

为完成 IntelliSort 的设置，请将偏转板放置在分选仪中的正确位置，并将电压调至约 3,000 伏。选择六管架作为分选输出。在流指示器上选择液流以启用它们，并执行测试液流。

启用 IntelliSort 自动液滴延迟确定按钮，以设置正确的液滴延迟时间，并再次验证液流。然后激活 IntelliSort 维持模式，手动验证液滴延迟时间。在分选仪软件中加载手动液滴延迟方案，并获取荧光控制微球。

插入正确的载玻片架后，选择分选，然后依次选择延迟丢弃向导和分选逻辑。使用荧光显微镜确认97%的荧光微珠存在于第五个液滴中。开始前，设置细胞分选仪并激活IntelliSort。

完成散射校准后，对每个样本执行样本采集步骤。要创建样本分选的新方案，请在工具栏中依次选择文件、方案和新建。单击分选软件中的数据采集设置。

在采集参数窗口中，选择感兴趣的通道并禁用其他通道。然后将装有样品的5 mL离心管放入进样器中。在触摸屏上，单击加载按钮。

在分选软件的工具栏上，选择采集，然后点击开始。当样本属性窗口出现时，输入样本名称并点击确定。为创建设门策略，选择直方图，然后创建直方图。

创建三个点图，第一个点图的 X 轴为 488-FSC1-Height 对数，Y 轴为 488-SSC-Height 对数；第二个点图的 X 轴为 488-FSC-2 Height 对数，Y 轴为 488-SSC-Height 对数；第三个点图的 X 轴为 488 513 X 26 CFSE Height 对数，Y 轴为 488-SSC Height 对数。点击采集，然后点击开始，并输入样品名称。

采集过程中，圈选识别CFSE阴性细胞群和CFSE阳性细胞群的区域。随后在分选选项卡中，确定需要分选的区域。当流速稳定后，选择采集，然后点击停止。

开始分选时，在分选仪软件的工具栏中选择“分选”功能。如需保存分选设置，请在工具栏中选择“分选”，然后点击“保存分选设置”。为检测分选后细胞群体的纯度，首先以高差压条件采集5 mL清洗液，持续10分钟，随后采集5 mL去离子水，同样持续10分钟。

获取经0.22微米滤膜过滤的PBS，并确认其中不存在CFSE阳性事件。然后将5微升分选后的样本加入100微升经0.22微米滤膜过滤的PBS中进行稀释。采集分选后的样本并记录体积。在经CFSE分选后，脂肪来源的细胞外囊泡中CD9、CD63、CD81和CD44的表达未发生变化。

纳米颗粒示踪分析显示，囊泡在分选前后其大小分布保持一致。透射电子显微镜分析表明，分选过程未显著改变囊泡的形态。此外，经0.1% Triton X-100处理后，CFSE阳性囊泡数量减少，证实了其囊泡来源。