优化流式细胞分选参数以实现小细胞外囊泡的高通量分离与纯化
2023年1月20日
本方案通过优化空气喷雾喷嘴尺寸、鞘液压力、样品流压力、电压、增益和触发阈值等参数，提供了一种快速且基于尺寸特异性的外泌体小细胞外囊泡分离方法。
本方案通过优化流式细胞分选参数，为小型细胞外囊泡提供了一种快速且基于粒径特异性的分选方法。这些优化提供了一组关键的分选参数设置，使研究者仅通过前向散射光与侧向散射光即可获得具有代表性的小型细胞外囊泡群体。首先，执行流式细胞分选仪的标准开机程序。
按下启动按钮打开设备，然后点击激光控制面板上的激光电源按钮。在智能采样器子菜单中按下更换储液罐按钮，以对流体系统加压。使用经超声清洗的50微米喷嘴和气流喷嘴，并将其安装至喷嘴组件下方。
在压力控制台上，将鞘液流的压强调节至80 SI，样品流的压强调节至80.3 SI。按下启动鞘流按钮，以开始鞘液流的流动。在Smart Sampler子菜单中点击去气泡按钮，自动去除气泡10分钟后关闭该功能。
为对准液流并确定激光光斑位置，打开照明室光源，通过针孔观察液流。调节上下、左右以及前后微调旋钮，使液流在针孔处居中并对液流进行聚焦。打开所有激光快门，选择激光与液流交汇选项卡，然后根据提示持续按压绿色箭头按钮，完成激光交汇与喷嘴对准校准过程。
进入精细激光校准界面。将 640 纳米激光器和 772 栏 44 带通通道设置为 x 轴参数，将 405 纳米激光器和 448 栏 59 带通通道设置为 y 轴参数。按下触发参数选择器，并选择 488 纳米激光器的前向散射参数。
接下来，将一滴彩虹荧光微粒加入 1 毫升双蒸水中，稀释至终浓度为每毫升 1 × 10⁶ 个微粒。打开样品室门，装载一支已制备好的彩虹荧光微粒管。按下开始进样按钮，并调节上下微调旋钮以优化荧光强度，使每个信号尽可能强。
按下触摸屏控制面板上的“开始质控”或“QC”按钮，以自动执行质控程序。然后按下 IntelliSort 初始化按钮。仪器将自动调节液滴振荡的频率和振幅，以获得约 25 的液滴延迟，并能清晰地观察到液滴断裂点。
接下来，按下延迟液滴按钮和保持按钮。选择离心管作为分选输出类型。将一个15毫升离心管架放入分选室中。
打开极板电压，并将极板电压设置为约 4,000 伏特。接着，通过选择流设置按钮来开启测试图案。调节充电相位滑块和偏转滑块，以确保液流的图像与收集管对齐。
然后选择对号按钮。登录计算机上的 Summit 工作站。通过文件主菜单创建新协议。
然后，在 Summit 软件控制面板中选择直方图选项卡，创建一个点图。将前向散射设为横轴参数，侧向散射设为纵轴参数。接着，在工作区中右键点击新点图的坐标轴，将前向散射和侧向散射以对数形式显示。
选择采集选项卡并找到采集参数面板。在启用参数的子菜单中启用所有信号。选择前向散射作为触发参数，并将阈值设置为 0.01。
将前向散射和侧向散射的电压和增益分别调整为250和0.6，以确保前向散射与侧向散射图中的事件和细胞群能够分离。将荧光聚苯乙烯微球加入1毫升双蒸水中，稀释成100、200和300纳米的悬浮液（每种悬浮液加入1微升微球）。然后依次加载微球悬浮液。
在Summit软件的采集菜单下选择“开始”，记录20,000个事件，记录完成后点击“停止”。右键单击前向散射与侧向散射点图以创建矩形，拖动以调整大小。通过右键单击电子噪声区域和100纳米微球群体区域，将其分别重新命名为R7和R4，并重新定位这些区域。
重复上述步骤，依次用矩形框选200和300纳米的微球，并将其分别重命名为R5和R6。最后，根据电子噪声及200纳米颗粒的位置确定50至200纳米的分选区域，并将其定义为R8。在分选逻辑与统计面板中，通过双击左侧空白区域或L1流的空白字段，选择名为R8的区域以编辑分选逻辑。为L1流选择纯度优先的中止模式，并选择大于一个液滴的液滴包络。
加入500微升预先制备的细胞外囊泡（EVs）混合液样品。在Summit软件的采集菜单下点击“开始”按钮以获取数据，然后点击“停止”。接着，在分选菜单中点击“开始”，将50至200纳米大小的小细胞外囊泡（sEV）收集到一个15毫升离心管中。
通过流式细胞术分析标准尺寸的聚苯乙烯微球，以在前向散射与侧向散射图中确定50至200纳米粒径范围，结果显示可区分的颗粒信号。R4、R5和R6分别代表100、200和300纳米颗粒的位置。R7为电子噪声，表示50纳米颗粒的检测限，R8表示50至200纳米颗粒的位置范围。
通过纳米颗粒追踪分析（NTA）检测，经超速离心后从胰腺细胞来源的细胞外囊泡（EVs）混合物的粒径分布范围较宽，为40至400纳米。采用流式细胞分选技术对R8区域内的50至200纳米小细胞外囊泡（sEV）进行分离与纯化。通过NTA验证分离质量，结果显示分选后sEV的粒径范围为50至200纳米。
通过透射电子显微镜（TEM）进一步观察到sEV的存在，并通过蛋白质印迹分析证实所分离的sEV含有CD6、CD63和CD81标志物。该方法可实现小细胞外囊泡的分离，并支持对小细胞外囊泡基因表达进行分类或初步分析，从而为多种下游研究应用提供了可能。
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概述
本方案通过优化流式细胞术分选参数，为小型细胞外囊泡提供了一种快速且基于粒径特异性的分离方法。这些优化使得能够利用前向散射光与侧向散射光对小型细胞外囊泡的代表性群体进行有效获取。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 细胞外囊泡
背景
- 小型细胞外囊泡在细胞间通讯中发挥关键作用。
- 分离方法对于研究其功能至关重要。
- 流式细胞术是分离这些囊泡的有力工具。
- 优化分选参数可提高所分离样本的质量。
研究目的
- 建立一种小细胞外囊泡的快速分离方法。
- 优化流式细胞术参数以实现有效分选。
- 确保收集到具有代表性的囊泡群体。
使用的方法
- 流式细胞分选仪的标准启动程序。
- 激光功率和流体压力的优化。
- 使用经超声清洗的50微米喷嘴和气流喷口。
- 基于前向散射与侧向散射的分选。
主要结果
- 成功分离小细胞外囊泡。
- 建立流式细胞术分选的关键参数设置。
- 展示获得的代表性细胞群。
- 提高分选过程的效率。
结论
- 优化后的方案可提高小细胞外囊泡的分离效果。
- 流式细胞术可有效用于此目的。
- 未来的研究可在此优化参数的基础上进一步开展。
常见问题
行业应用价值
高通量、尺寸特异性的细胞外小囊泡（sEVs）分离对于推动生物制药研发中的可靠生物标志物发现和机制研究至关重要。由于长期以来缺乏标准化的sEV分离方法，转化医学研究及下游检测开发受到限制。目前优化的流式细胞分选参数可提供一种可重复、可放大的解决方案，用于获得高纯度的sEV群体，支持覆盖整个研发管线的生物标志物筛选和药物干预研究。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 通过靶点验证，实现对小细胞外囊泡（sEV）介导的信号通路的深入研究。
- 通过分离具有明确大小和标志物特征的囊泡，支持生物学风险降低。
- 通过减少样本异质性，提高功能研究中预测结果的可信度。
筛选与检测方法开发
- 为下游检测工作流程提供标准化、高纯度的小细胞外囊泡（sEV）制备样品。
- 通过最大限度降低背景噪声，提高检测的可重复性和定量结果的准确性。
- 支持对sEV相关生物标志物进行可扩展的高通量筛选。
转化与临床前研究
- 将sEV分离与疾病相关的生物标志物发现和验证相结合。
- 确保从发现到基于囊泡特征的临床前评估的连续性。
- 通过保证样本的一致性，降低转化研究中混杂变量的风险。
流程与工作流整合
这种优化的流式细胞分选方法可整合到从发现到临床前研究的连续流程中，支持早期靶点验证以及后续的转化研究。
- 发现生物学：通过分离具有明确特征的囊泡，实现假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供可重复、定量的小细胞外囊泡（sEV）样本，用于检测方法开发和化合物评估。
- 分析：基于粒径和标志物提供可靠的读数，实现不同条件间的比较分析。
- 转化研究：通过标准化小细胞外囊泡（sEV）分离，支持生物标志物的一致性及临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用、可扩展的小细胞外囊泡（sEV）分离平台，适用于多个研发项目。
运营与企业影响
- 科学价值：提高sEV研究的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、可重复且可扩展的sEV分离流程。
- 战略价值：通过实现可靠的生物标志物研究，提升“推进/终止”决策的准确性与资本使用效率。
- 项目组合影响：支持基于风险调整的囊泡相关发现项目的优先排序与推进。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术和囊泡生物学方面的专业知识，以优化参数选择。
- 需要使用高灵敏度流式细胞仪及相应的分析基础设施。
- 需要跨团队统一门控和分选方案的标准。
- 针对不同细胞来源或囊泡群体可能需要调整设置参数。
- 实际限制因素包括仪器的灵敏度，以及在较小尺寸阈值下可能与电子噪声发生重叠。
