优化冷冻电子显微镜样品制备

冷冻样品制备面临一些可能限制其有效性的挑战，尤其是颗粒分布不均的问题。这一问题常常导致新构建的蛋白质结构分辨率降低和准确性下降。为克服颗粒分布不均，已采用多种实验方法，包括在样品中添加去污剂或膜模拟物、修饰载网支撑膜，以及在数据采集过程中倾斜特定角度的样品台。

本方案介绍了一种通过优化样品制备来解决颗粒分布不均问题的简单实用方法，为研究人员高效利用冷冻电镜揭示大分子结构提供了参考。首先，收集含有MJ小热休克蛋白16.5的蛋白组分混合液。使用截留分子量为50千道尔顿的离心过滤装置，在4°C条件下将组分浓缩至约65毫克/毫升。

浓缩后，在4°C条件下以16,000 G离心10分钟，以去除聚集体。将上清液分装至0.2毫升薄壁PCR管中，每管50微升。进行透射电子显微镜观察时，将两管冷冻保存的蛋白质样品置于冰上解冻。

解冻后，轻轻弹击离心管数次以混匀。随后在4摄氏度条件下，以16,000 G离心10分钟，去除蛋白溶液中的聚集体。接着将上清液上样至尺寸排阻色谱柱，并收集0.5毫升的洗脱组分。

收集对应于峰值的洗脱组分，该组分在280纳米处表现出最高的紫外吸收。为进行缓冲液置换，用剪刀将透析膜剪成30 × 30 毫米的片状。将这些片状物在蒸馏水或缓冲溶液中孵育，以使其平衡。

接着，将55 µL蛋白溶液加入含有50 µL微透析按钮的腔室中。用镊子将透析膜垂直夹住，轻轻将膜的一边接触滤纸以吸去多余液体。小心地用透析膜覆盖微透析按钮。

将 O 型圈放在透析膜顶部，轻轻将其滚入按钮边缘的凹槽中。将每个透析按钮分别浸入盛有目标缓冲液的烧杯中，透析膜一侧朝上。使用带细针头的注射器小心刺穿膜，从微透析室中回收蛋白质溶液。

将浓度为每毫升20至120纳克的样品5微升加样至经辉光放电处理的载网。在石蜡膜片上制备三滴各50微升的水滴。将载网表面轻轻擦拭水滴，以洗涤样品。

现在将5 µL过滤后的1%醋酸铀溶液滴加到载网上，立即用移液器吸除醋酸铀溶液。再向载网上滴加5 µL醋酸铀溶液。用滤纸轻轻接触载网的镊子一侧，除去多余的染色液，然后让载网自然干燥。

将镊子和辉光放电处理的载网组件安装到仪器上。然后将四微升样品加载到载网的碳膜面。启动浸入式冷冻程序。

为准备将载网装入透射电子显微镜（TEM），首先将装有玻璃化载网的载网盒放入自动载网组装站，并拧开装有玻璃化载网的载网盒盖。将自动载网环放置在组装站指定的凹槽位置。小心地将玻璃化载网从载网盒中取出，并将其安装到自动载网环内。

现在将圆盘对齐，使圆形开口位于自动网格环和网格组件的上方。要将网格固定到自动网格环中，请将C型夹插入工具放在网格上方，轻轻按压以将C型夹固定到位。然后将圆盘旋转回原位，并将组装好的网格移入自动网格储存盒中。

组装卡带装载站并用液氮冷却。将自动网格存储盒放入装载站中。将网格组件从自动网格存储盒转移至卡带中。

使用手柄将盒式架放入自动加载胶囊中。检查自动加载器中的针头，确认其可自由移动，确保针头未被卡住。在所有测试的载网上均观察到阵列中的颗粒聚集现象，无论缓冲条件或表面电荷修饰如何。

在9毫摩尔的mobstress、50毫摩尔的氯化钠和0.1毫摩尔的EDTA缓冲液中，较高的蛋白浓度结合带负电荷的载网，可实现网格孔内单颗粒的理想分布，减少蛋白聚集物的形成。该优化条件获得了0.80的高圆锥形FSC面积比值和0.859的SCF值，证实了颗粒分布的均匀性。