使用高分辨率X射线吸收光谱法在低温条件下进行物种分析的生物样品制备

该方案已针对细胞样本进行了标准化，可实现不同同步辐射光源地点之间实验结果的比较。该技术的主要优势在于其简单直接的工作流程，能够快速且可靠地保存样本的化学完整性。初次使用该技术的研究人员可能在冷冻反复离心获得的细胞沉淀以及快速将细胞沉淀装入冷冻样品架的过程中遇到困难。

在低温条件下精确且快速地分离样品至关重要。因此，直观的演示对于理解该技术的操作方法必不可少。为进行硒形态分析而制备人前列腺癌和卵巢癌细胞系的细胞沉淀时，需在超净台中将每种细胞系适当数量的细胞分别接种至每种条件下三个T-75培养瓶中，加入合适的细胞培养基，随后将培养瓶置于37°C、5% CO₂的细胞培养孵箱中，直至细胞融合度达到80%。

为了使癌细胞接受硒处理，首先将新配制的纳米颗粒储备液在室温下置于超声水浴中震荡30分钟，随后用完全细胞培养基将硒纳米颗粒溶液连续稀释至适当的工作浓度。在超净工作台内，用5毫升37摄氏度的PBS轻柔洗涤细胞两次，每次洗涤后弃去液体，并使用无菌的25毫升移液管将15毫升目标硒处理溶液小心地沿培养瓶底部加入。盖上瓶盖但不要完全密封，然后将培养瓶水平放置于细胞培养箱中孵育24小时。

在洗涤并更换培养基后，准备细胞沉淀时，每个培养瓶使用一把细胞刮棒轻轻刮下细胞。用培养基冲洗粘附在培养瓶上的细胞，使其进入上清液，并通过离心收集解离的细胞。每次洗涤时，每管用五毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞沉淀两次，以彻底去除残留的处理试剂，最后将细胞重悬于一毫升 PBS 中。

将细胞转移至1.5毫升聚丙烯管中，通过另一次离心收集细胞。然后使用200微升移液器轻轻吸除所有上清液，并将每个1.5毫升管的底部浸入液氮中，直至与细胞沉淀物齐平。细胞冻结后立即转移至液氮杜瓦瓶中进行长期保存。

对于高分辨率X射线吸收光谱分析，需将晶体分析光谱仪中的所有晶体针对目标荧光线能量在布拉格条件下进行优化，并使用已知吸收边能量位置的参考物质对入射单色光束能量进行校准。将样品架转移至液氦低温恒温器中用于生物样品，并将低温恒温器设定为10开尔文，随后依照同步辐射安全规程关闭实验屏蔽舱，开始分析。此处展示的硒在初始状态以及在营养培养基中孵育后的细胞中的代表性高分辨率X射线吸收光谱表明，初始硒纳米颗粒中的硒以零价硒和类纤维素形态同时存在。

然而，在与 PC3 细胞相互作用后，硒主要以零价硒的形式存在于细胞内，表明细胞内的硒形态发生了变化。对于铁元素，高分辨率 X 射线吸收光谱参考谱图根据铁的氧化态表现出明显的边位置差异，还原态铁物种的谱边向低能量方向偏移。在硅藻沉淀物的同一位置连续采集的两条光谱相似，表明使用 10 开尔文氦气低温恒温器时，两次采集之间的光束损伤有限。

此外，来自硅藻沉淀物不同位置的光谱完全相同，表明样品压片具有均一性，且光谱可进行平均处理以获得信噪比更优的光谱。最关键的步骤包括纳米颗粒稀释液的制备、低温条件下的离心沉淀，以及标准参比样品的制备。该方法可应用于其他体相分析技术，例如电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICP-MS），或其他可在低温条件下实施的非同步辐射光谱技术。

该实验方法还可用于探索其他科学问题，特别是在生物地质学、生物化学、环境科学或毒理学研究领域。硒化合物和硒纳米颗粒可能对健康有害，操作时应使用手套、护目镜和面罩，并在专用的化学通风橱中进行。