用于透射电子显微镜的微型化样品制备

该方法有助于解答结构生物学领域的关键问题，例如在蛋白样品有限的情况下对敏感性蛋白进行制备。该技术的主要优势在于，与常规样品制备方法相比，仅需极微量的样品，且无需进行剧烈的滤纸吸干步骤。该技术的应用前景涵盖通过可视化蛋白质组学实现单细胞分析，以及蛋白质相关疾病的诊断。

我们最初产生这一方法的想法是在技术条件允许仅用约 100,000 个单独粒子即可解析高分辨率结构时。首先，按照随附的文字实验方案制备样品。接着，组装乙烷杯、冷冻盒支架和载网架。

然后用液氮将冷冻剂容器完全装满。数分钟后，杯子将冷却且内部的液氮会完全蒸发。接着打开乙烷气瓶，缓慢将气体通入乙烷杯中。

让液态乙烷充满杯子，直至液面低于杯口两到三毫米。此过程需要几分钟，约需五毫升液态乙烷。取下蜘蛛夹具，盖上聚苯乙烯盖子，将低温容器放置于冷冻写入仪的支架上。

使用冷冻书写仪镊子夹住发出辉光的EM载网，将镊子固定在电磁铁上，然后调节显微操作器，使载网平整地置于载物台上，碳膜面朝上。返回软件界面，双击 grid_save。随后调整微毛细管的位置，使其尖端位于载网表面上方约10微米处。

确保微毛细管能够在网格上自由移动，且任何位置均不与网格接触。如有必要，将微毛细管回撤数微米。然后将其重新移回网格中心位置，并将该新位置保存为网格位置。

将微毛细管移回初始位置。接着，用几十纳升的系统液体冲洗微毛细管，并使用无绒纸巾擦去微毛细管上的任何液滴。一切准备就绪后，启动宏脚本。

该宏程序首先移动到指定位置，并注入5纳升系统液体以清除针尖处的任何气泡，然后移动至样品位置。接着，吸取65纳升样品，再将5纳升回注到样品管中。此操作可补偿系统回程误差，并实现同步书写。

移动到网格位置后，启动写入模式，使微毛细管在网格上移动，同时分配 45 纳升样品。随后，将微毛细管移回网格中心，再下降 10 微米，并吸除多余的样品液体。最后，宏程序收回微毛细管并关闭电磁铁，从而触发 plunge freeze 机制。

从磁铁上释放后，小心地将磁性适配器从柱塞上松开，并迅速将载网从乙烷杯转移至装有冷冻盒的低温容器中，将载网放入一个空闲的卡槽内。首先，按照随附的文字实验方案制备细胞，并将氧化铟锡载玻片安装到显微镜插入件上。使用两颗螺丝将载玻片固定在铝制插入件上，以确保载玻片的氧化铟锡涂层与接地的铝制框架之间形成良好的电接触。

然后从孔中移除细胞培养基，并用 300 微升电穿孔缓冲液洗涤细胞两次。最后一次洗涤后，将细胞保留在电穿孔缓冲液中。接下来，将固定着氧化铟锡载玻片的铝制插入件放置在活细胞培养箱载物台上，置于已准备好的装置中。

使用显微镜定位细胞培养区域，并选择一个无细胞的区域。将微毛细管尖端移至载玻片表面并轻轻接触，然后将尖端回撤100微米，并将该位置保存为细胞位置。

现在迅速离开细胞培养环境，用几十纳升的系统液体冲洗微毛细管尖端，然后再次将其放入细胞培养环境中。浸入PDMS孔时，释放几纳升液体，以确保尖端无气泡滞留。双击细胞位置，轻柔地接近氧化铟锡载玻片表面，接触后将尖端回撤10微米。

此时，选择一个邻近的细胞进行裂解，并将微毛细管的尖端置于目标细胞上方。然后启动单细胞裂解的宏脚本程序。

程序启动后，系统将提示输入微毛细管在成功裂解细胞后应移动到的位置。请输入期望的位置，例如用于电镜载网的“grid”。随后，宏程序将在无需用户干预的情况下继续运行，首先将显微镜载物台在细胞培养区域向左移动100微米，并对目标细胞拍摄一张快照。

然后，微毛细管移液管释放出15纳升双蒸水，置换并稀释高盐缓冲液，从而对细胞施加渗透压。接着，载物台移动，再次将移液管尖端定位在目标细胞上方。在此位置，施加预设的电压脉冲，500毫秒后，泵系统开始以每分钟2微升的流速吸取3纳升样品。

最后，载物台再次向左移动，以便对细胞进行观察。此时会弹出一个窗口，提示用户输入信息。如果细胞处理成功，则输入“是”以拍摄裂解后细胞的快照。

随后，将微毛细管移至内侧位置，浸入储液池的液体中。根据喷嘴的几何形状，使微毛细管在液体中浸没8到12分钟。接着，将五纳升经处理的细胞裂解液滴加到载网上。

取出微毛细管，让已处理的样品在露点台上缓慢干燥。最后，将载网从台上取下，并置于室温下的载网盒中保存。此处展示的是使用所述 CryoWriter 装置制备的冷冻样品的典型冷冻电镜图像。

在网格概览图中，可以清楚地看到玻璃态冰的边缘区域。仔细观察含有玻璃态冰的带孔碳膜网格孔洞时，可见一些白色孔洞，表明并非所有孔洞都充满了样品缓冲液。在其中一个含有样品的碳膜孔洞中，可清晰地观察到噬菌体尾部的细节结构。

使用CryoWriter进行单细胞可视化蛋白质组学分析时，可以观察到诸如单个蛋白质（例如丝状肌动蛋白）以及带有附着蛋白的膜片段等结构。图6b所示图像采用基于有机钨化合物的2%负染剂进行负染。图c显示的是为冷冻电镜制备的单细胞裂解液。观看本视频后，您应能够充分掌握如何从纳升级总体积的蛋白质样品或单细胞提取物中制备负染或冷冻电镜载网。

请注意，操作液态乙烷和氮气可能具有极高危险性，进行此操作时必须采取预防措施，例如佩戴护目镜和实验服。