单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学
2025年1月24日
动力蛋白超家族蛋白的功能依赖于与GTP水解相偶联的构象变化。本文描述了一种利用单分子FRET（smFRET）技术监测类动力蛋白GTP酶atlastin在不同核苷酸负载状态下构象动态变化的系统。
我们致力于研究细胞内膜的融合机制。在本方案中，我们旨在通过单分子FRET技术揭示内质网膜融合蛋白atlastin在其GTP水解循环过程中的构象动态。atlastin在GTP水解循环中可能以单体或二聚体形式存在。
在单分子实验中，寻找合适的蛋白质标记和固定策略具有挑战性，以下展示了 atlastin 在 GTP 水解循环过程中的构象动态。与整体 FRET 相比，smFRET 能够精确监测蛋白质在不同核苷酸结合状态下的构象变化，从而直接揭示调节分子的行为特征。我们利用 smFRET 全面解析了 atlastin 在不同固定策略下的 GTP 水解循环过程。
我们相信，我们的研究结果将推动对GTP水解蛋白构象动力学的更深入研究，并为罕见生物学过程提供新的解读。为清洁盖玻片表面，使用镊子夹取八片盖玻片并放入染色缸中。加入50毫升丙酮以浸没盖玻片，并将染色缸置于超声波清洗仪中处理30分钟。
用双蒸水将盖玻片冲洗三次，然后在超声波清洗器中用甲醇洗涤。接着，将piranha溶液加入染色缸中，在95摄氏度的水浴锅中加热两小时。待染色缸冷却至室温后，用双蒸水将盖玻片冲洗六次。
将甲醇钠溶液加入染色缸中，置于超声波清洗器中处理15分钟。用清水冲洗盖玻片后，向染色缸中加入重蒸水，再置于超声波清洗器中处理15分钟。用夹子将盖玻片固定于染色缸中，并用氮气吹干。
将干燥的盖玻片转移至另一个染色缸中，将染色缸置于烘箱中于120摄氏度下烘烤30分钟。随后，在干燥器中冷却至室温。向烧杯中加入47.5毫升甲醇、2.5毫升乙酸和0.5毫升三乙氧基硅烷，并混合均匀。
将混合物转移至染色缸中，孵育10分钟。在染色缸中用双蒸水冲洗盖玻片三次，并超声处理5分钟。如图所示，用清水冲洗盖玻片并用氮气吹干后，将盖玻片放入直径为10厘米的培养皿中。
将 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-Biotin 按照 1:100 的比例溶解于高盐溶液中。将制备好的混合液滴加到盖玻片上，并用另一张盖玻片覆盖。在适当湿度条件下孵育两小时或过夜。
修饰后，将盖玻片分开，用去离子水冲洗，并用氮气吹干。小心地将修饰后的盖玻片放入一个50毫升离心管中。在纯化于Rosetta大肠杆菌细胞中表达的发动蛋白样蛋白atlastin（ATL）的GTP酶结构域后，使用10千道尔顿的离心滤膜将蛋白质缓冲液置换为蛋白质生物素化缓冲液。
进行蛋白质生物素化时，将各100微升的100毫摩尔ATP、100毫摩尔乙酸镁和500微摩尔D-生物素，10微升100微摩尔BirA生物素连接酶，以及50微摩尔目标蛋白质混合，定容至1毫升。在4摄氏度下孵育过夜。次日，使用截留分子量为10千道尔顿的离心过滤装置去除游离的D-生物素。
将20微升生物素标记的蛋白与20微升15微摩尔的链霉亲和素在冰上孵育20分钟。使用SDS-PAGE检测蛋白生物素标记效率。将LD555和LD655荧光染料溶于二甲基亚砜，配制成终浓度为5毫摩尔的溶液。
配制标记缓冲液时，混合25毫摩尔的HEPES、150毫摩尔的氯化钾和5毫摩尔的氯化镁。使用10千道尔顿的离心滤膜将蛋白质缓冲液置换为标记缓冲液。进行分子内单分子FRET实验时，按1:1.2:1.2的比例混合ATL1cyto-TK、LD555和LD655，最终体积为100微升。
将混合物在 4°C 条件下孵育 5 小时。进行分子间 smFRET 实验时，将 ATL1cyto-K 与 LD555 以及生物素标记的 ATL1cyto-K 与 LD655 在 4°C 条件下共同孵育 5 小时。为制备蛋白质固定化反应室，请使用定制的双面胶带小心地将修饰后的盖玻片和显微镜载玻片粘合。
安装管路和接头，构建一个具有六个通道的微流控腔室。为进行映射校正，取10微升10%的聚苯乙烯微粒滴加到显微镜载玻片上，并盖上盖玻片。然后，在全内反射荧光显微镜下选择一个含有聚苯乙烯微粒的视野，以明场模式采集一段视频。
使用自定义脚本对齐供体和受体通道中同一聚苯乙烯颗粒的中心位置。将地图文件保存为 TXT 文件。对于分子间单分子荧光共振能量转移（smFRET）实验，将 LD555 标记的 ATL1cyto-K 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素按 1:1 的比例混合，GTP-γ-S 的终浓度为 1 毫摩尔。
将混合物置于冰上孵育一小时，以使蛋白质二聚化。在ATL1cyto-T与ATL1cyto-K的分子间单分子FRET实验中，将LD555标记的ATL1cyto-T与LD655标记的ATL1cyto-K-biotin按1:1比例混合，并加入1毫摩尔的GTP-γ-S。将混合物置于冰上孵育一小时，以获得二聚化的蛋白质。
然后，对于分子内单分子FRET实验，将标记有LD555和LD655的ATL1cyto-TK与1毫摩尔的GDP在冰上孵育1小时。对于分子间实验，加入10微克/毫升的链霉亲和素，孵育10分钟以固定蛋白质。对于分子内实验，加入10微克/毫升的生物素化抗His抗体，孵育10分钟以固定蛋白质。
孵育后，将稀释的ATL1二聚体加入通道中的蛋白质，使其固定10分钟。用孵育缓冲液冲洗通道两次。向通道中加入苯甲酸和PCD，终浓度为2.5毫摩尔。
选择532纳米激光作为激发光源。将EMCCD相机设置为以30毫秒的帧间隔记录数据。以16位TIFF格式保存录制的视频。
数据采集完成后，从录制的视频中提取FRET轨迹。选择并以TXT格式保存FRET轨迹。从TXT文件中提取数据，并使用MATLAB编写的自定义脚本计算FRET值。
使用 Origin 中的 GaussAmp 拟合 smFRET 数据，以获得分布直方图。
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概述
本研究利用单分子FRET（smFRET）技术探究内质网膜融合蛋白atlastin在GTP水解循环过程中的构象动态。该研究强调了在单分子实验中蛋白质标记与固定策略所面临的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 生物物理学
背景
- 动力蛋白超家族蛋白在膜融合过程中起着关键作用。
- 在GTP水解过程中，atlastin可以以单体或二聚体形式存在。
- 单分子FRET技术可提供有关蛋白质构象的信息。
- 理解atlastin的动力学特性对于阐明膜融合机制至关重要。
研究目的
- 探究 GTP 水解过程中 atlastin 的构象变化。
- 利用单分子 FRET（smFRET）监测蛋白质在不同核苷酸结合状态下的动态行为。
- 解决单分子研究中蛋白质标记与固定所面临的技术挑战。
使用的方法
- 单分子FRET（smFRET）技术。
- 蛋白质标记的实验策略。
- 单分子实验中的固定化技术。
- GTP水解循环动力学的分析。
主要结果
- 单分子FRET可有效监测atlastin的构象变化。
- 不同的核苷酸结合状态影响atlastin的动力学行为。
- 解决了标记与固定化过程中的技术难题。
- 获得了关于atlastin GTP水解循环的新见解。
结论
- 单分子FRET是研究蛋白质动态的有力工具。
- 理解atlastin的构象变化有助于阐明膜融合机制。
- 未来的研究可基于这些发现进一步探索其他动力蛋白样蛋白。
常见问题
行业重要性概述
对atlastin蛋白进行单分子FRET（smFRET）成像，可直接、定量地揭示GTP酶驱动膜融合过程中的构象动态，该过程与神经退行性疾病机制密切相关。该方法能够高分辨率地探究蛋白质的力化学功能，有助于在药物靶点早期验证和机制去风险化中建立预测信心。该技术在监测核苷酸依赖性构象状态方面的精确性，使其成为专注于膜融合和GTP酶生物学的生物制药研发管线中可重复使用的工具。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 实现对与疾病相关的GTPase构象转变的直接观测。
- 通过将核苷酸状态与结构动力学关联，支持机制层面的风险评估。
- 通过实时单分子分析，促进功能靶点的验证。
- 提高对膜融合靶点组合筛选的预测可信度。
筛选与检测方法开发
- 建立经过验证的单分子检测方法，用于定量构象读数。
- 可在定义明确的核苷酸状态下，实现对蛋白质动力学的可重复测量。
- 支持检测方法的标准化，便于后续对调节剂或抑制剂进行筛选。
- 提供一个可扩展的、高内涵的机制性筛选平台。
转化与临床前研究
- 将构象生物标志物与疾病相关的机制性终点相匹配。
- 确保从分子发现到GTPase功能临床前验证的连续性。
- 通过提供定量的机制证据，降低推进决策的风险。
- 支持针对与atlastin功能障碍相关的罕见神经退行性疾病开展转化研究。
流程与工作流整合
atlastin 的单分子 FRET 成像融入了从早期机制研究到检测方法开发及转化研究的发现全过程，从而实现了迭代式的假设检验与功能验证。
- 发现生物学：提供GTP水解过程中构象变化的定量证据，阐明其分子机制通路。
- 筛选：提供可重复、定量的FRET输出结果，用于比较分析核苷酸状态及调节分子。
- 分析学：生成高通量的单分子数据，用于蛋白质构象的统计学比较。
- 转化研究：将分子动力学与神经退行性疾病相关的表型相联系。
- 企业级复用：提供一个模块化平台，可用于研究除atlastin以外的其他力化学蛋白。
运营与企业影响
- 科学价值：提高靶点验证中的预测可信度，降低机制上的模糊性。
- 操作价值：标准化单分子检测的工作流程，以实现可重复性和可扩展性。
- 战略价值：为决策提供依据，通过降低早期靶点的风险提升资本使用效率。
- 项目组合影响：支持对膜融合和GTP酶相关项目的基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备单分子荧光和蛋白质生物化学方面的专业知识。
- 需要专用仪器设备，例如全内反射荧光显微镜（TIRF）和电子倍增CCD相机（EMCCD）。
- 需要对标记和固定化实验方案进行严格的跨团队标准化。
- 应用于其他机械化学蛋白时，可能需要优化标记策略。
- 通量和数据分析依赖于强大的计算基础设施和自定义脚本。
生物制药常见问题
Chapters in this video
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Introduction
1:22
Preparation and Modification of Coverslips for Protein Immobilization in Chambers
4:12
Protein Biotinylation and Fluorophore Labeling for Single-Molecule Frster Resonance Energy Transfer (smFRET) Assays
6:41
Single-Molecule FRET Imaging and Data Analysis for GTP Hydrolysis Cycle of Atlastin
