杂合组装与单分子检测技术用于成像完全重建的CMG的运动

我们在单分子水平上研究真核复制体不同组分的运动动态，以深入定量地理解细胞如何在每个细胞周期中复制其完整的基因组。2015年的一项突破性进展实现了从纯化的蛋白质组分在体外完全重建真核DNA复制系统，这使我们能够对该系统进行高度可控的操作。自那以来，该系统被广泛用于回答有关DNA复制各个阶段的问题，并且时间与空间分辨率不断提高。

这一研究采用了互补的方法，例如冷冻电镜（cryo-EM）和单分子生物物理学技术。在单分子研究领域，该系统面临的主要挑战之一是所涉及的蛋白质数量较多，以及为实现整体反应效率最大化所需各组分的浓度问题，因为这些因素可能使单分子成像变得复杂。本文所述的实验方案介绍了一种混合方法：首先利用群体生物化学手段高效组装蛋白复合物，随后将其引入并应用于单分子研究体系中进行分析。

这可以避免在单分子水平上引入过高的蛋白质浓度。我们以复制解旋酶CMG在DNA上的行为研究为例，说明该方法在通过基于复制起点的途径组装后，于单分子水平进行研究的应用。但该方法也可用于研究多种其他类型DNA结合蛋白复合物的动力学过程。

在对线性DNA底物的两端进行功能化修饰后，继续进行反应。首先取出S400离心柱，涡旋振荡至少30秒，以充分重悬树脂。随后在735 G下离心1分钟，以去除保存缓冲液。

将各列转移至洁净的1.5毫升离心管中。立即向每根柱中加入100微升双功能化线性DNA溶液。在735 ×g条件下离心2分钟，使DNA流过柱体，同时保留未掺入的核苷酸。

将来自四个柱子的含有 DNA 的穿流液合并后，用移液器测量其体积。接着，将 M280 链霉亲和素包被的磁珠涡旋振荡 30 秒以重新悬浮。将 4 毫克重悬的磁珠转移至一个洁净的 1.5 毫升离心管中。

将试管置于磁力架上静置一分钟，使磁珠沉降，然后移除保存缓冲液。加入1 mL缓冲液A，涡旋振荡5秒以重悬磁珠，随后在室温下孵育5分钟。将试管置于磁力架上静置一分钟，使磁珠沉降。

去除缓冲液A后，用移液器将磁珠重悬于400微升2倍浓度的缓冲液A中。然后，向磁珠中加入400微升功能化DNA溶液，并用移液器轻轻混匀。将磁珠-DNA混合物在4摄氏度下以头尾翻转的方式旋转孵育过夜。

第二天，使用磁力架去除上清液，然后计算结合到磁珠上的DNA总量。接着，依次用缓冲液B和缓冲液C洗涤磁珠。将磁珠重悬于300微升缓冲液C中，并分装成四份，每份75微升。实验开始时，取一份75微升的分装样品，其中含有1毫克DNA结合的链霉亲和素包被磁珠，用磁力架去除上清液。

用200微升上样缓冲液洗涤磁珠。然后将磁珠重悬于75微升上样缓冲液中，通过移液轻轻混匀。接着，向结合DNA的磁珠中加入终浓度为37.5纳摩尔的起始识别复合物，在30摄氏度下以每分钟800转的速度振荡孵育5分钟。

加入Cdc6，终浓度为50纳米，按照之前所述条件孵育反应体系。然后加入Mcm2-7/Cdt1，终浓度为100纳米，按照先前所述条件孵育反应20分钟。随后，加入Ddk，终浓度为100纳米，同样孵育30分钟。

去除上清液后，用200微升高盐洗涤缓冲液洗涤含有磷酸化Mcm2-7六聚体的磁珠结合DNA。通过移液混合，确保磁珠完全重悬。接着，移除缓冲液，并用200微升CMG缓冲液洗涤磁珠一次。

为了在磁珠结合的DNA上组装并激活荧光标记的CMG复合物，首先去除CMG缓冲液，并将结合DNA的磁珠重悬于50微升含有5毫摩尔ATP的CMG缓冲液中。接着，将屏幕上列出的所有组分混合于同一管中，并置于冰上。立即将重悬的磁珠结合DNA加入蛋白质混合物中。

在30摄氏度、800 RPM振荡条件下孵育反应15分钟。依次用HSW缓冲液和CMG缓冲液洗涤磁珠。去除缓冲液后，将含有DNA结合磁珠的CMG重悬于200微升洗脱缓冲液中。

然后，在室温下以 800 RPM 振荡孵育一小时。将离心管置于磁力架上，静置五分钟，使磁珠完全沉降。小心吸取上清液（含洗脱的 DNA-CMG 复合物），避免扰动已沉淀的磁珠，并将其转移至新的离心管中。

为确保溶液中无残留微珠，将收集的上清液再次置于磁力架上，静置五分钟。小心收集上清液并转移至新离心管中。向200微升上清液中加入1,400微升CMG缓冲液。

样品现已准备好进行单分子成像。在结合了双光束光镊与共聚焦显微镜的商用装置中进行单分子成像。使用注射通道一用于捕获微珠，通道二用于DNA-蛋白质复合物结合，通道三用于检测CMG的存在，通道四和通道五作为蛋白质储存区及缓冲液置换位置。

在进样口以0.5 bar的恒定压力将所有溶液注入流通池。然后，关闭第四和第五通道的流体流动。在初始阶段将所有溶液流过之后，将压力降至0.2 bar。

将捕获激光移动至通道一，直至每个光镊中捕获一个微珠。按住触发器的同时移动操纵杆，将被捕获的微珠移至通道二。不按触发器，仅使用操纵杆，通过将右侧微珠向左侧微珠方向来回移动，直至捕获一条DNA-CMG复合物的DNA tether。

将珠子移至第三通道，并立即停止所有通道的流动。在激发激光面板中将561纳米激光功率调整为四微瓦，然后对第三通道中的DNA进行单帧测试扫描。如果存在CMG，其将呈现为二维衍射极限的点状信号。

在此情况下，将DNA连接物移至通道四或通道五进行成像。否则，重新开启流体，弃去微珠并重复上述步骤。在通道四或通道五中，在力谱面板中输入2皮牛顿，然后单击启用按钮以启动力钳模式。

当初始张力达到两皮牛顿时，再次点击力谱学面板中的启用按钮，关闭力钳，然后进行成像。点击图像扫描面板中的开始扫描按钮。使用561纳米激光器，以物镜处测量功率为四微瓦的条件，每五秒对荧光标记的CMG进行一次成像。

在无聚集反应中，CMG 表现为离散、对称且衍射受限的斑点，稀疏地分布在 DNA 上。相反，聚集物则不够清晰，有时呈现为不对称的团块，密集地占据较长的 DNA 区域。如果实验成功实施且纯化的蛋白质具有高纯度，则可在 ATP 存在下观察到 CMG 的长距离运动。