利用唾液酸糖微阵列检测技术分析人血清中抗Neu5Gc IgG

唾液酸糖阵列检测的总体目标是以高通量方式评估人血清中针对多种唾液酸糖的抗Neu5Gc IgG抗体。该方法有助于解答糖免疫学领域的关键问题，例如抗Neu5Gc抗体如何参与包括癌症、心脏病和异种移植在内的多种人类疾病。该技术的主要优势在于，能够对针对大量唾液酸糖抗原的抗Neu5Gc抗体进行高通量分析。

演示该实验操作的是我实验室的硕士生 Sharon Yehuda。在芯片制备和布局方面进行细致周密的规划对于确保实验成功至关重要。该过程在文本方案和补充信息中有详细说明。

将每种糖类用微离心管中的糖芯片打印缓冲液稀释至100微摩尔，总体积为100微升。接着，用标记缓冲液将含伯胺的荧光染料配制成每毫升含1毫克的溶液，然后将其稀释至每毫升含1微克，总体积为1毫升。

按照文本方案中的说明配制人IgG标准曲线稀释液。将384孔板置于冰上。使用电子多通道移液器，根据文本方案中提供的板式布局，向各孔中加入7 µL的每种聚糖、标记物和标准曲线IgG。

用封口膜覆盖培养板，在12°C、250 ×g 条件下离心2分钟。打印必须在湿度为60%至70%的无尘环境中进行。此处所有步骤均在洁净室中进行，并佩戴适当的防护手套和服装。打开纳米打印机和加湿器。

按照文本方案中所述设置好打印仪后，将含有分装样品的384孔板放置到点样仪载台的指定位置，并移除封口的帕拉膜。此时开始进行打印。使用耐酒精溶剂的标记笔为载玻片编号，并将其置于避光的真空密封盒中保存。

处理芯片时，首先从真空密封盒中取出一张载玻片，将其放入化学通风橱中，芯片面朝上放置五分钟，以挥发多余的液体。接着，将载玻片置于盛有去离子水的染色管中进行水化。用铝箔覆盖管口，在室温下缓慢轻柔振荡孵育五分钟。

为了封闭载玻片上的活性环氧基团，将载玻片浸入装有预热的乙醇胺封闭液的50毫升染色管中。用铝箔覆盖管口，在室温下缓慢轻柔振荡孵育30分钟。将乙醇胺封闭液弃入适当的生物危害废弃物容器中。

然后，将玻片放入装有50摄氏度去离子水的新且洁净的染色管中。用铝箔覆盖管口，在室温下缓慢轻柔振荡孵育10分钟。弃去水溶液，将玻片转移至玻璃染色架中。

将装置放入摆动板架中，离心使载玻片干燥。接着，将载玻片置于16孔分隔板上。在预润湿各孔后，使用多通道移液器向载玻片的各孔中加入200 µL PBST。

然后，将它们放入一个加盖的湿盒中，振荡孵育5分钟。轻弹并轻轻拍打于干净的纸巾上以去除PBST。随后，每孔加入200 µL PBS-牛血清白蛋白封闭缓冲液。

将切片置于湿盒中，在室温下轻轻振荡孵育一小时。接着，按照文本方案所述，用 PBS-OVA 封闭缓冲液稀释制备一抗。轻弹去除切片上的 PBS-OVA 封闭缓冲液，每孔加入 200 微升一抗。

将切片置于湿盒中孵育两小时。然后轻轻甩去切片上的初免检测试剂，并用PBST洗涤三次。最后用PBST洗涤一次前，将切片在湿盒中用PBST孵育五分钟。

然后，用 PBS 洗涤一次。接着，按照文本方案中的描述，用 PBS 配制二抗。从载玻片上甩去 PBS，加入 200 µL 二抗。

轻弹掉切片上的二抗，然后用PBST如前所述清洗四次。小心取下框架，将切片放入盛有PBS的50毫升切片染色管中，振荡5分钟。接着，用去离子水填充两个切片染色槽。

将载玻片放入载玻片架中，浸入第一个染色缸。快速浸入10次。然后将载玻片转移至第二个染色缸，再浸入10次。

浸渍后，将载玻片在室温下振荡孵育10分钟。孵育结束后，弃去液体，将载玻片转移至玻璃染色架中。将玻璃染色架放入摆动板架内，离心使载玻片干燥。

打开扫描仪门，将玻片放入，芯片面朝下。此时开始扫描。将扫描后的玻片保存为TIFF文件。

为准备用于分析的芯片，请选择“加载阵列列表”，并上传相应的 GAL 文件，该文件可映射芯片上每个区块中的阵列。该芯片包含 16 种不同的主要检测单元，每个区块中各有一种。植物凝集素 SNA 可结合 α2-6 连接的唾液酸。

植物凝集素MALII结合α2-3连接的唾液酸。多克隆抗Neu5Gc IgY可结合含Neu5Gc的唾液酸聚糖，但不结合含Neu5Ac的唾液酸聚糖。为分析抗Neu5Gc IgG，采用含唾液酸聚糖的打印微阵列检测12份健康人供体血清，并使用荧光标记的抗人IgG进行显色，结果标准化为每微升纳克（ng/µL）。

所有检测的人血清均含有不同水平的抗 Neu5Gc IgG，且几乎不识别含 Neu5Ac 的配对唾液酸糖链。此外，这 12 份不同血清之间的抗 Neu5Gc IgG 识别模式在信号强度和多样性方面均表现出高度差异。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用糖芯片系统以高通量方式对多种人源样本中的抗 Neu5Gc 抗体进行谱型分析。