制备并使用荧光和放射性示踪剂标记微泡

微泡是充满气体的超声敏感性颗粒，具有独特的癌症成像和治疗能力。通过构建以应用为导向的可示踪微泡，可战略性地拓展其不断发展的应用前景。为促进实现这一目标，我们开发了一种脂质微泡制备方案，可定制化地制备无标记、放射性标记、荧光标记以及多模态微泡。

实现高效且稳定的微泡放射性标记是一项非同寻常的挑战。脂质微泡较为脆弱，因此在制备后进行放射性标记时，若涉及加热、长时间处理或纯化步骤，可能会干扰其理化特性及稳定性。另一方面，制备前放射性标记则需要专用设备，并会增加辐射暴露风险。

我们通过开发一种新的杂交方案来克服这些挑战，该方案在微泡激活之前、但脂质悬浮液形成之后进行放射性同位素螯合。这种“一锅法”策略首次实现了高效、无需纯化的微泡放射性标记，同时保持了微泡颗粒的理化性质。该方案另一个关键优势在于其通用性：既可在从头定制微泡制备过程中整合使用，也可适用于市售的预制微泡脂质悬浮液。该方法可成功应用于多种不同的微泡脂质和螯合剂组合，因而能够制备出具有特定功能的放射性、荧光性或三模态微泡。

这些特性共同实现了对微泡脂质外壳的多模态示踪，有助于深入理解其作用机制，并推动以微泡为核心的超声治疗在多个领域的应用发展，包括微泡药代动力学研究、多模态成像、治疗方案设计以及协同治疗的实现。

[旁白] 开始使用微量移液器时，沿小瓶中选定的微泡脂质膜边缘加入一毫升 AA-PGG 溶液，避免产生气泡。将瓶盖部分盖住瓶口，留出足够空间插入全氟戊烷（PFP）导管。将 PFP 气体通入小瓶液面上方顶空区域 20 秒，然后盖紧瓶盖。将小瓶下半部分浸入 70 至 80 摄氏度的水浴中加热一分钟。随后在 69 摄氏度的超声水浴中超声处理小瓶 30 秒。超声结束后，擦拭小瓶并使其冷却至室温。用 PFP 气体重新填充小瓶顶空区域，然后盖紧瓶盖，并用 Parafilm 膜密封瓶口边缘。在结晶皿中设置 60 摄氏度水浴，将磁力搅拌子放入皿中，并将结晶皿置于温控加热搅拌板上。将温度探针插入水中以监测温度，并调节搅拌速度，形成微弱但可见的漩涡。使用镊子将装有氯化铜（以 0.1 N 盐酸形式存在的铜-64）的密封小瓶转移至活度计中，记录铜-64 的活度及测量时间。再用镊子将小瓶从活度计中取出，放入铅容器中。为计算单位为兆贝可每毫升（MBq/mL）的数值，将活度计读取的活度除以铜-64 溶液的体积。打开脂质悬液小瓶瓶盖，并将其固定在小瓶架上。然后使用镊子打开铜-64 小瓶瓶盖。用微量移液器吸取相当于 40 至 250 兆贝可活度的铜-64 溶液，转移至脂质悬液中。使用带扁平橡胶头的镊子，上下翻转放射性脂质悬液至少五次，使铜-64 充分混入悬液中。当小瓶直立时，轻轻弹击瓶盖，同时稳定小瓶。小心地部分打开瓶盖，插入连接 PFP 气体的针头。向小瓶顶空区域通入 PFP 气体 20 秒，然后盖紧瓶盖并用 Parafilm 膜密封。使用活度计测量小瓶的放射性活度，并记录时间。接下来，将小瓶放入泡沫小瓶架中，使小瓶下半部分暴露于热源。将泡沫架浸入 60 摄氏度的搅拌水浴中，加热一小时。在此期间，准备 iTLC 薄层色谱条：将玻璃微纤维色谱纸裁剪成条状，并在 80 摄氏度的玻璃干燥烘箱中加热以活化。一小时后，从水浴中取出小瓶，用纸巾擦拭瓶口边缘。使用带橡胶头的镊子上下翻转小瓶。当小瓶直立时，轻轻弹击瓶盖，同时稳定小瓶。移除 Parafilm 膜，擦拭瓶盖周围以去除残留水分。取 1 至 2 微升脂质悬液，点样于已活化的 iTLC 色谱条底部中央一厘米处。让点样斑点自然干燥。使用微量移液器向 10 毫升试管底部加入 200 微升 iTLC 展开剂。将试管置于铅容器中。将点样后的 iTLC 色谱条放入试管中，展开至展开剂前沿距色谱条顶端约一厘米处。随后，用镊子取出已展开的色谱条，垂直持握。在与伽马计数器兼容的 5 毫升塑料管上方，将色谱条剪成三段。向各管中插入推盖。使用伽马计数器测量各含色谱条的试管及一个空白对照管中的铜-64 活度。记录每分钟计数（CPM），并从其他读数中减去空白管的计数，以校正本底辐射。然后根据校正后的每分钟计数计算放射化学纯度。接下来，打开放射性标记脂质悬液小瓶的瓶盖，向悬液中加入 8.89 微升 1 N 氢氧化钠溶液。盖紧瓶盖并翻转混匀小瓶，轻轻敲击瓶身以去除瓶盖空腔中残留的悬液，然后用 PFP 气体填充顶空区域。将小瓶置于机械振荡器上，以 4,530 转每分钟（RPM）振荡 45 秒，生成乳白色的微泡悬液。待其自然冷却至室温后，轻柔地倒置小瓶以重新悬浮微泡悬液。将小瓶平放于台面，静置两分钟。在此期间，将 1 毫升塑料注射器装配 18 号针头，并通过反复抽吸和排出空气的方式排出注射器内空气。两分钟后，迅速打开小瓶瓶盖，从小瓶底部吸取 400 至 550 微升悬液。小心擦拭针头边缘，将微泡悬液转移至微量离心管中。盖紧管盖后，使用活度计测量最终微泡产物的放射性活度，并记录时间。将测得的活度值除以倾取体积，得到单位为兆贝可每毫升（MBq/mL）的活度浓度。首先，取 10 至 200 微升微泡悬液，加入适配的 0.5 毫升、30,000 分子量截留的微量离心过滤装置中，置于配套的微量离心管内。在室温下以 12,000 × g 离心 10 分钟。接着，使用剪刀剪断微量离心管与其管盖之间的连接。将管盖放入标记为“CAPS”的 20 毫升闪烁液小瓶中。将过滤装置转移至标记为“TUBE 2”的新微量离心管中。将含有上清液的第一支微量离心管放入标记为“TUBE 1”的 20 毫升闪烁液小瓶中。向 TUBE 2 中的过滤装置加入 200 微升重蒸水。再次以 12,000 × g 离心 10 分钟。最后一次转移过滤装置后，向 TUBE 3 中的过滤装置加入 200 微升蒸馏水并进行离心。离心结束后，剪下离心管的管盖，将其加入管盖闪烁液小瓶中，并将过滤装置转移至新标记为“UNIT”的 20 毫升闪烁液小瓶中。将 TUBE 3 放入新的 20 毫升玻璃闪烁液小瓶中。盖紧五个闪烁液小瓶，并准备一个空的、加盖的闪烁液小瓶作为空白对照。使用伽马计数器测量六个闪烁液小瓶中的铜-64 活度。从其他小瓶的测量值中减去空白对照的计数。计算放射性标记或螯合效率。