优化、设计及规避手动多重荧光免疫组织化学中的陷阱

多重荧光免疫组织化学可识别完整福尔马林固定石蜡包埋组织中的多种细胞类型及其位置，不仅能够实现细胞鉴定，还可进行细胞间的空间分布分析。该手工技术的主要优势在于可使用同一物种的多种抗体而不会产生交叉反应。该技术能够深入揭示肿瘤微环境中免疫细胞与癌细胞之间的相互作用。

首次尝试该技术时，应预留大约三到四天的染色时间，并在过程中完整记录每一步操作。采用较为温和的染色方法和多重设计对于减少常见且可预见的问题至关重要。首先对切片进行脱蜡和再水化处理。

将切片置于杂交炉中，组织面向上，于60摄氏度烘烤1小时。从烘箱中取出切片，置于垂直切片架中冷却5至10分钟。然后使用切片染色套装依次用二甲苯处理3次，再分别用100%乙醇、95%乙醇和70%乙醇各处理1次，每次10分钟。

用去离子水清洗载玻片架，然后将载玻片浸入中性缓冲福尔马林中固定30分钟。用自来水清洗载玻片2分钟，随后进行抗原修复。将载玻片架放入盛有pH 6.0或pH 9.0抗原修复缓冲液的耐热盒中。

用塑料膜覆盖盒子，并用橡皮筋固定。将盒子置于带有翻转装置的微波炉中，放在旋转盘的边缘位置，先以100%功率加热载玻片45秒，随后以20%功率继续加热15分钟。微波处理后，让载玻片冷却15至20分钟。

同时，准备抗体和荧光染料的工作液。通过将 0.5 克牛血清白蛋白颗粒溶解于 50 毫升 TBST 或 1× PBS 中来配制一抗稀释液。将每种一抗工作液稀释至先前确定的最佳浓度。

将每种荧光染料用荧光染料稀释液稀释至浓度为1到100。在染色的最后一天，向1毫升TBST中加入三滴DAPI，配制DAPI工作液。待切片冷却后，从微波炉中取出并揭去塑料膜。

用去离子水清洗两分钟，随后用 TBST 清洗两分钟。清洗后，用洁净擦拭纸轻轻擦干组织周围的玻片，并用疏水屏障笔沿组织外周划线，注意不要触碰组织或使其干燥。将每张玻片放入湿盒中，并在组织上加入约四滴封闭液。

然后将切片在室温下孵育10分钟，随后进行一抗孵育。通过将切片边缘轻触纸巾堆吸去切片上的封闭液，并用精细擦拭纸去除残留液体。将切片放回湿盒中，每张切片上加入约200 µL工作浓度的一抗溶液，孵育1小时。

孵育结束后，将载玻片浸入TBST中，每次洗涤2分钟，共洗涤3次。用吸水纸轻轻吸去每张载玻片上残留的TBST，然后加入3至4滴二抗。将载玻片置于湿盒中孵育10分钟。

用 TBST 再次洗涤载玻片，并加入约 100 微升荧光染料工作液。将载玻片放回湿化孵育盒中，孵育 10 分钟。重复 TBST 洗涤，然后根据文章说明对载玻片进行微波处理，以去除抗体。

在此多日染色过程中，需牢记的一个重要事项是：在微波处理步骤后停止操作，并将切片置于抗原修复缓冲液中过夜，以确保组织和染色的完整性。使用抗原修复液去除最后一次抗体孵育，随后用去离子水清洗切片，再用TBST清洗，每次清洗两分钟。重复其余抗体-荧光染料配对的染色步骤，然后进行DAPI染色。

向每张载玻片加入约 150 微升工作浓度的 DAPI 溶液，在湿盒中孵育 10 分钟。孵育结束后，用 TBST 洗涤载玻片约 30 秒，然后加盖盖玻片。待封片剂干燥后，在盖玻片的四个角处涂抹透明指甲油以固定盖玻片。

为了分析单plex，使用DAPI对载玻片进行显微成像，曝光时间为250毫秒以实现聚焦。通过观察染色标志物的荧光强度，并将其与背景强度进行比较，来评估每张单plex载玻片。如果染色标志物的强度至少比背景高五倍，则在最终的多重检测中使用该载玻片位置。

进行多重染色时，选择每种抗体的适当染色顺序，并为每种抗体分配相应的荧光染料。按照先前所述步骤进行多重染色，并准备一张空白对照玻片，该玻片中加入一抗稀释液、荧光染料稀释液和 TBST，以替代一抗、荧光染料或 DAPI。当准备在显微镜下成像时，将所有通道的曝光时间设置为 250 毫秒，并使用 DAPI 对焦后采集每张图像。

然后使用分析软件通过荧光伪彩和病理学视图评估每个多重标记，以确认每种标志物的特异性。为了确保多重检测的成功，需要先进行单重检测，以确定每种抗体的孵育顺序。例如，当 Foxp3 位于阵列的第三位时，可观察到特异且强健的染色，并与 CD3 实现共定位。

相比之下，当 Foxp3 位于第一位置时，会出现 Foxp3 的非特异性染色。大多数切片区域呈现颗粒状和弥散状的红色，且这些区域的荧光强度较低。该检测中的另一个重要步骤是 DEPI 复染，这是细胞鉴定和进一步分析的基础。

在使用正常和失效的 DAPI 所获得的图像之间可以观察到明显的对比。对于多重检测，美观的复合图像并不总是反映真实的染色结果。尽管 CD3 能够被可视化并显示出特异性染色，但 CD163 的病理学明场图像证明该抗体具有非特异性结合。

理想的多重成像在复合图像中展示出特异性染色，且CD3和CD163的特异性可通过病理学明场视图确认。通过该方法，可进行自我表型分析和空间分析计算，以进一步研究细胞间的相互作用。该技术为研究人员探索细胞和完整组织的空间分布模式开辟了道路，进一步加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。