用于表征荧光标记微泡在超声触发药物释放中应用的多时间尺度显微方法

本方案可用于表征专为超声触发药物递送应用而设计的荧光标记微泡的响应特性，包括其激活机制和生物效应。关键在于结合多种成像技术，使我们能够在不同空间尺度和时间尺度上揭示微泡介导的超声触发药物递送这一多尺度问题。进行明场显微镜单个微泡成像时，使用19号排气针，并用配备19号针头的1毫升注射器从玻璃小瓶中取出少量微泡悬液，转移至小管中，以便下一步更方便地进行移液操作。

使用移液器将微泡溶液用过滤后的磷酸盐缓冲液稀释。用10毫升注射器将样品注入样品池的一个出口，直至样品池充满且无气泡产生，必要时可继续注入更多样品。关闭样品池的两个阀门，并将样品池垂直放置于显微镜的光轴方向。

在样品分析前，先在任意波形发生器上设定所需的超声驱动频率和声压。从样品池的一个角落开始观察视野，使用XYZ载物台移动样品池，使单个微泡位于显微镜的视野范围内，然后将连接至水浴的光纤连接到频闪灯，并开始记录。每种超声参数设置下可重复成像任意所需次数，每次分析时需将样品池移动至少两毫米，以确保新视野中包含未经超声辐照的微泡。对于微泡的荧光显微成像，在磷酸盐缓冲盐水中稀释微泡溶液（方法如前所述）后，于任意波形发生器上设定所需的超声驱动频率和声压，并在脉冲延迟发生器上设定激光触发延迟时间，以实现对微泡中纳米颗粒的荧光激发。随后使用XYZ载物台移动样品池，定位单个微泡并将其调整至物镜的焦平面上，然后触发记录。

根据需要，通过调整超声设置并移动样本架至新的视野范围来重复成像操作，操作方法如前所述。进行活体显微成像时，首先将加热的动物固定装置放置在波导与物镜之间的XY定位平台上，并在波导表面添加耦合凝胶。将尾静脉导管插入麻醉后的荷瘤小鼠尾静脉中，并将安装有观察窗室的小鼠放入加热的固定装置内。

在盖玻片上添加一滴水。为了观察肿瘤组织的血管结构，通过尾静脉导管静脉注射 30 微升浓度为 4 毫克/毫升的荧光标记 2 兆道尔顿葡聚糖，然后使用 XY 平移载物台移动小鼠，直至找到具有合适血管的视野。根据实验参数调整帧率、视野范围和录像时长，并记录血管的基线图像。

在获取基线图像后，于任意波形发生器上设定超声驱动频率、脉冲长度和声压幅度，并通过静脉注射将 50 µL 微泡样品注入尾静脉。随后按照演示方法对血管系统进行成像。通过共聚焦荧光显微镜对微泡进行分析，结果显示微泡壳层的颗粒分布不均匀。

微泡的整体结构可通过扫描电子显微镜进一步观察。利用明场显微镜分析超声辐照下微泡的径向动力学行为及其现象学特征，可评估微泡半径随时间的相对变化。此处展示了一个典型成功递送荧光标记纳米颗粒的图像序列。

当激光照射到微泡时，可观察到嵌入微泡壳中的纳米颗粒发生荧光。然而，如本例失败的递送所示，荧光纳米颗粒仅在微泡壳表面发光，而微泡在超声暴露期间保持完整。活体多光子成像可用于确定纳米颗粒在超声暴露过程中时空外渗情况，这有助于理解并优化超声介导纳米颗粒递送的潜在机制。

在所有空间和时间尺度上实现光学与声学通路的完美对齐，为超声触发的药物递送提供了全面深入的理解。我们通过多尺度实验所获得的结果，现将被转化为临床实践。这些结果将为包括癌症治疗在内的多种治疗应用提供宝贵的见解。