量化细胞在颗粒状水凝胶生物材料内部及向其内部的三维迁移

我们的研究重点是利用颗粒状水凝胶的独特性质，研究细胞在组织再生过程中的运动行为与功能。在理解其转化应用意义时，对细胞微环境响应的建模至关重要。随着三维多孔支架的应用日益增多，迫切需要更全面的三维迁移检测方法，以更真实地模拟细胞在伤口愈合环境中的行为。

我们开发了两种从支架构建到成像与分析的三维实验流程，用于体外研究细胞运动与迁移。通过这两种新建立的检测方法，我们能够在伤口愈合的两个不同阶段追踪响应细胞：一是从大块组织向支架的初始浸润阶段，二是细胞被复杂支架包围后的移动阶段。首先，在96孔板的每个孔中，以每平方厘米接种120,000个人类皮肤成纤维细胞，至少设置六个复孔。

经过过夜孵育后，使用移液器或抽吸装置从细胞孔中移除培养基。使用正向置换移液器，将每种凝胶条件下的 20 微升染料加入各孔中。使用设定为 25 摄氏度的板式旋转转子离心机附件，以 100×g 离心 15 秒，加速度和减速度均设为 8，以使凝胶表面平整。

将培养板旋转180度，再次离心，以确保凝胶在孔底均匀分布。为无菌光交联凝胶，使用365纳米的聚焦光照处理30秒，使支架退火。所有支架形成后，向每孔中加入200 µL培养基，在37 °C孵育30分钟。

使用共聚焦显微镜对细胞进行成像，以捕获其迁移行为。进行图像分析时，打开 Imaris 图像转换软件以进行批量转换。将显微图像拖放到转换软件中，并在软件界面内选择一个文件夹以导入文件。

依次选择每个文件以设置体素大小。按下“全部开始”以启动转换。接下来，在 Imaris Arena 软件中，从 arena 中选择一幅图像以开始处理。

单击主工具栏中的“图像处理”选项卡。然后，单击通道1的下拉菜单并选择“背景减除”。按“确定”返回3D视图。

在小型工具栏中，单击标有“添加新表面”的蓝色圆润形状图标，以创建名为“表面 1”的可编辑对象选项卡。使用蓝色箭头按钮手动为所有重复样本生成参数。将表面细节设置为 0.7 微米，并选择背景减除和局部对比度。

将平均细胞长度输入到可容纳于对象框内的最大球体的直径中。对于阈值分割，确定强度直方图以仅分割最亮的细胞。启用“分割相接触对象”、“区域生长”功能，并将种子点直径设置为与先前使用的直径一致。

为保存用于批量分析的创建参数，请点击标有“Creation”的魔棒图标。点击“store parameters for batch”，命名文件，然后点击“OK”。为收集所有细胞高度，请点击“Detailed”选项卡。从下拉菜单中选择特定数值，然后选择“Position Z”。

单击保存图标，将所有Z轴位置和分类信息导出为XLS文件。首先，在超净工作台中将PBS倒入培养皿，然后用移液器将20微升细胞培养液滴加到培养皿倒置的盖子上。将盖子重新放回培养皿上，并将培养板进行孵育，以获得悬滴培养的3D球状体。

使用正向置换移液器将15微升凝胶无菌加入透明96孔板的孔中，以设置PLOSMA。使用板式旋转转子离心机附件，在1,000g条件下离心10秒，使凝胶表面平整。将板翻转180度后再次离心，以确保凝胶分布均匀。

然后，使用365纳米的聚焦光照射30秒，以退火支架并从顶部对凝胶进行光交联。将悬挂液滴的培养皿无菌转移至组织培养罩内，并将皿盖倒置。使用20微升移液枪，缓慢吸取一个液滴，直至类球体进入枪头，然后将液滴挤出至孔中央的支架上。

将培养板置于37摄氏度孵育2小时，使类球体附着于支架上。孵育后，用移液器在每个类球体上方再添加15微升凝胶。以300g离心15秒，每个方向各一次，以确保凝胶均匀分布。

使用紫外线照射使凝胶顶层退火，方法如前所述。将培养板置于共聚焦显微镜下，在选定最低和最高Z平面后对类球体进行成像。将图像导入Imaris Arena软件后，点击通道1的下拉菜单，选择背景扣除。

点击面板底部的“确定”按钮。在3D视图中，按下“显示调整”弹出窗口中的“自动调整所有通道”按钮，并根据需要进行校正。在较小的工具栏中，单击“添加新参考帧”图标，以创建一个标为“参考帧1”的选项卡。

将原点在三个平面上均移动至类球体的中心。在同一工具栏中，单击带有橙色球体的图标以添加新的点，创建一个名为 Spots 1 的选项卡，然后按蓝色箭头按钮继续。进行阈值分割时，调节强度直方图，仅分割最亮的部分。

使用切片器浏览图像堆栈以确保准确性。按三次蓝色的“下一步”箭头。取消勾选“在切片器上渲染”，或点击设置面板上的黄色方形图标。

单击“统计”选项卡。在下拉菜单中，选择特定值和距原点参考系的距离。单击“保存”图标。

为保存所有更改和分析结果，请点击主工具栏中的保存图标。该方法被用于评估组织界面处的细胞浸润情况。迁移细胞在Z轴上的中位位置从0小时到24小时显著增加，表明细胞发生了明显的垂直移动。

沿Z轴的细胞迁移倍数变化在24小时后增加了一倍。采用PLOSMA方法接种的细胞在24小时后表现出从类球体核心显著扩散和迁移的现象。三维重建图像显示，PLOSMA支架中的细胞在24小时后广泛铺展，并可见向外延伸的突起结构。

使用“斑点”功能处理后的3D图像显示，细胞在支架中的位置呈分散分布，表明细胞发生了广泛的迁移。细胞迁移的平均距离超过200微米，且在不同样本间结果一致。PLOSMA支架中细胞的Z轴高度折叠变化约为4，表明细胞有显著的向上移动。