创建黏附性与可溶性梯度以荧光显微镜成像细胞迁移

本实验的总体目标是构建黏附性梯度和可溶性梯度，以研究细胞迁移。首先通过钝化表面以防止细胞非特异性黏附，从而实现该目标。第二步是利用微接触印刷技术制备印模。

接下来，通过微接触印刷技术在经处理的表面印制链霉亲和素条带。也可使用连接在微流控装置底部的蘸笔光刻技术将链霉亲和素打印成点状。经修饰的表面将作为生物素-RGD黏附梯度的基底。

最后一步是在可溶性趋化因子梯度存在的条件下，将细胞接种到含有黏附信号的表面。最终通过活细胞显微镜观察细胞对黏附信号和可溶性信号的迁移反应。该技术相较于现有的方法（如Transwell或空白腔室实验以及传统的微流控装置）的主要优势在于，这种表面图案化微流控装置的分离式系统能够同时观察细胞对空间可控的黏附信号、黏附梯度以及可溶性梯度的响应。

该方法有助于解答细胞迁移领域中的关键问题，例如细胞黏附的重要性，以及趋化因子受体（如受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联受体）与黏附受体（如RIN）之间相互作用所引发的信号传导机制。首先，将盖玻片放入盛有100%乙醇的烧杯中，置于超声水浴中震荡清洗30分钟。随后将玻璃盖玻片在空气中晾干。

接下来，将玻璃盖玻片在1 M氢氧化钠溶液中进行超声处理30分钟。随后，将放置盖玻片的架子小心地浸入盛有1.5升超纯水的烧杯中，轻轻晃动以冲洗玻璃表面。每次使用新鲜的超纯水，重复冲洗过程三次。

第三次漂洗后，将玻璃盖玻片置于 60 摄氏度的烘箱中干燥约半小时。取一半洁净的玻璃盖玻片，分别放入由 24 孔板制成的湿盒中，该湿盒内装有部分水。在孔中加入水后，将玻璃盖玻片覆盖于孔上方以进行孵育。使用一种聚赖氨酸与聚乙二醇的共聚物，其中 20% 的聚乙二醇分子接枝有生物素。

简称为PLL Peg生物素，将15微升的PLL Peg生物素PBS溶液滴加到每片玻璃盖玻片上。取剩余洁净玻璃盖玻片的另一半，小心地将PEG溶液夹在中间。将盖玻片置于湿润 chamber 中孵育一小时。

一小时后，将夹心状的盖玻片轻轻分开，避免刮擦聚乙二醇（PEG）涂层表面，并用超纯水冲洗。水应能轻易地从经PEG处理的一侧滑落。如有必要。

将玻璃盖玻片处理面朝上置于纸巾上空气干燥。将玻璃盖玻片存放在真空干燥器中，直至后续使用。本实验所需的硅胶母模通过光刻法制作，用于浇铸聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体的A-P-D-M-S印章。在培养皿中将PDMS浇注到硅胶母模上，厚度约为一厘米，然后将母模与PDMS混合物置于70摄氏度的烘箱中固化一小时。

随后，将PDMS印章从硅母模上取下，并裁剪至合适尺寸，以用于微接触印刷技术印制蛋白图案。首先，需对PDMS印章进行清洁处理，并通过紫外-臭氧清洗仪处理印章的图案面一个半小时，以增强其亲水性。臭氧处理后应立即进行下一步操作。将10微升链霉亲和素（stripped adin）均匀涂布于PDMS印章表面。若需在荧光显微镜下观察轨迹，请使用与荧光染料偶联的链霉亲和素，例如与LOR three 50偶联的stripped avid。

在湿盒中静置一小时。用纸巾和空气吹干去除印章上的多余链霉亲和素，然后将印章干燥约一分钟。

将印章轻轻按压到PLL peg生物素包被的玻璃盖玻片上。如果使用了荧光链霉亲和素，可在落射荧光显微镜下观察图案。蛋白质图案也可通过蘸笔光刻技术进行打印。

首先将一份浓度为1毫克/毫升的Streptavidin或Stripped Avidin Elif Fluor 350与十份甘油混合，取5 µL该混合物加载到悬臂上。调节打印速度、悬臂与表面的接触时间或悬臂与表面之间的垂直距离，以减小斑点尺寸。

大约五微米开始进行打印过程，具体操作如蘸笔光刻仪器手册中所述。所有打印表面均置于干燥器中。使用市售的微流控装置来创建表面梯度。

将涂有或图案化三丁基锡的玻璃盖玻片粘附到装置的粘性侧，以确保数小时内无泄漏。用一层温热的凡士林密封装置边缘，并用一层凡士林与石蜡按1:1比例混合的物质进行二次密封。向装置的通道中加入6 µL PBS，以形成两个相对的浓度梯度。

将两个储液池分别加入70微升生物素、四种荧光素，以及70微升与生物素化肽精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）偶联的生物素，在室温避光条件下孵育样品一小时。冲洗微流控装置中的生物素、RGD以及生物素荧光素是该实验步骤中最困难的部分，因为存在困住气泡并扰动微接触打印轨迹的风险。为确保成功，必须小心缓慢地去除生物素和PBS。

从微流控装置上移除生物素溶液，并在仍连接于微流控装置的状态下，用 PBS 轻轻冲洗表面两次。在将荧光标记的细胞加入微流控装置前，标记黏附梯度的方向。对细胞进行计数，并将其平均分为两管，每管细胞数量相等。

洗涤并重悬。将一管细胞悬浮于含有趋化因子的培养基中，例如含10%胎牛血清的低糖DMEM，洗涤后；另一管细胞则悬浮于不含趋化因子的培养基中，例如含0%胎牛血清的DMEM。每管中细胞的终浓度应为每毫升5 × 10⁵个细胞。

从微流控装置中移除所有溶液，并将其放置在预热的显微镜载物台上。向一个储液 reservoir 中加入 70 微升用 0% FBS DMEM 重悬的细胞，向另一个储液 reservoir 中加入 70 微升用 10% FBS DMEM 重悬的细胞。

在储液池上松散地覆盖胶带以防止蒸发。确保微流控装置的通道位于视野范围内，且细胞处于聚焦状态。选择图像采集参数，例如曝光时间和荧光滤光片。

明场和荧光图像序列显示细胞及其轨迹，以及时间点和记录时长，启动图像采集程序。本视频演示了一种活细胞成像方法，用于观察在存在竞争性黏附梯度和可溶性梯度环境中迁移的细胞。通过微接触印刷或蘸笔光刻技术，制备了含有荧光标记链霉亲和素和生物素化RGD的黏附轨迹。

成功的微接触印刷可通过荧光强度在轨迹上的线性分布来判断，其中粘附轨迹与抗污区域应能清晰区分。采用蘸笔光刻技术打印的点状图案呈圆形而非泪滴形，表明印刷过程成功。在本示例中，点状图案以行列排列方式打印，行与列之间的间距设定为10至15微米。

该距离足以防止点状结构相互融合，同时允许在单个视野中观察到多个点。在大多数显微镜设置下，通过简单的微流控装置在打印轨迹上形成了黏附性信号的梯度。通过将生物素化四氟荧光素和生物素化RGD分别加载到微流控腔室面板的相对两侧实现。

显示了60张马赛克图像，总图像长度为3072微米。在B图中，沿整个马赛克的长度方向测量了荧光强度。对荧光强度拟合了线性趋势线，以指示通道中RGD的梯度。

去除生物素、生物素化 RGD 溶液后，同一腔室可用于引入可溶性梯度。图 A 显示了在时间 T 等于零时，靠近 PBS 和含荧光素染料的储液池以及通道内的荧光素荧光强度。图 B 显示了可溶性信号分子的荧光强度。

经过16小时孵育后，相似的结果表明，该梯度至少在16小时内保持稳定。通过此方法观察了微流控腔室中在相反梯度下的细胞迁移，此处展示了一段代表性视频。黏附性梯度是在链霉亲和素轨道上固定的RGD，而可溶性梯度为0至10%胎牛血清（FBS）。

每15分钟拍摄一次图像，共持续20小时。所示图像过渡速度为每秒8帧。这段第二个视频显示了一个heli细胞向FBS源迁移的过程。

所示图像过渡速度为每秒八帧。代表细胞轨迹的蓝线是通过细胞追踪软件获得的。最后这幅图展示了来自第一段视频中图像的细胞轨迹。

向可溶性FPS浓度较高区域迁移的细胞轨迹以红色显示，向黏附性RGD浓度较高区域迁移的细胞轨迹以黑色显示。这些轨迹表明，相较于黏附性RGD浓度较高的区域，更多的HeLa细胞向化学引诱物源方向迁移。在执行该操作过程中，需注意避免在黏附梯度制备和活细胞成像期间微流控装置中PBS或培养基的蒸发；如有需要，可在完成此操作后使用胶带覆盖微流控装置的所有入口。

为了回答有关细胞迁移过程中由蛋白质、黏着斑蛋白和受体介导的细胞骨架生物力学等其他问题，还可以进行转染和杂交溶液显微镜等其他方法。