小鼠脑-脊髓样本的提取与组织透明化制备

我们的研究聚焦于中枢神经系统如何介导认知功能，并与免疫系统相互作用。我们致力于改进检测脑和脊髓的方法，以解答有关这些相互作用的基本科学问题。这些方法能够保持脑和脊髓的完整，有助于我们利用组织透明化技术更全面地绘制细胞图谱。同时，该方法也使研究过程更加快速和准确，相较于传统的切片与成像方法，显著节省了时间并减少了误差。

我们已绘制出与肺部相连的大脑和脊髓区域。我们的研究将重点探索大脑、脊髓与肺部之间的神经-免疫通讯，以及这种相互作用如何影响免疫应答。

[指导教师] 首先，使用钢夹将小鼠的四肢固定在宽大的丙烯酸板上。用剪刀在两侧股骨之间剪开皮肤，并继续向上剪至横膈膜。沿横膈膜用剪刀和直镊子剪开胸腔两侧，暴露心脏。将连接灌流管的0.7毫米灌注针插入左心室，并在右心耳处做1至2毫米的切口。灌流完成后，使用眼科剪刀剪开小鼠背部和头部的皮肤。在两侧后肢上缘连线与脊柱相交处切断脊柱。去除小鼠颈部和背部的肌肉和脂肪组织，暴露脊柱和颅骨。使用静脉剪刀，从椎管下端开始，沿脊柱和脊髓左右两侧之间的中线间隙进行剪切。然后去除已切断的脊柱上段及两侧部分，暴露脊髓。重复上述步骤，直至到达脑连接处。将静脉剪刀的一侧刀尖置于枕骨大孔与脑组织之间，沿正中矢状缝滑动并剪开，以打开颅骨。用镊子移除颅骨，暴露脑组织。现在，使用镊子和静脉剪刀，从颅端开始取出小鼠脑-脊髓组织。在体视显微镜下，使用解剖镊子去除脊髓膜。接下来，用缝线将脑-脊髓样本固定在固定板上。加入至少20倍样本体积的4%多聚甲醛。固定完成后，弃去多聚甲醛，并用PBS洗涤样本三次。首先，将提取的小鼠脑-脊髓组织置于多聚甲醛中固定。对于脱脂溶液，按质量比9:1混合溶液A和溶液B。取50毫升脱脂溶液加入50毫升离心管中，并将固定后的组织放入其中。在溶液C中孵育后，更换溶液，并将盛有样本且完全浸没于溶液C中的培养皿放置在带有刻度线的光源盒上。配制凝胶溶液时，将147克溶液C和3克琼脂糖加入200毫升玻璃瓶中。用玻璃棒充分混匀后，微波加热至琼脂糖完全溶解。将凝胶溶液转移至设定为37摄氏度的实验室烘箱中。将37摄氏度预温的凝胶溶液倒入模具中，形成2毫米厚的液层，随后在4摄氏度冰箱中冷却30分钟，直至呈半固态。将折射率匹配的样本放入模具中，并加入凝胶溶液至与样本顶部齐平或略低于顶部。将模具重新放回4摄氏度冰箱中冷藏2小时。盖上盖玻片后再次冷藏。用镊子取下盖玻片，取出包埋的样本。向50毫升离心管中加入30毫升成像溶液，并将样本完全浸入溶液中。使用502胶水将样本牢固粘附于样本支架上，然后将支架固定在成像设备上。运行扫描软件，在放大倍数选项中选择4X放大级别。点击校准按钮以启动校准模式。点击预览按钮进入预览模式。然后点击Z轴方向移动按钮，缓慢将样本从样本室底部向上移动，直至生成的光片穿过样本。选择合适的激光通道和照明模式选项。选择样本的扫描路径方向。点击自动扫描按钮，开始采集样本图像。该方案成功保存了完整的小鼠脑和脊髓组织，同时维持了完整的荧光信号，实现了清晰成像。脑-脊髓样本的荧光成像清晰地显示了详细的神经结构。高倍镜图像进一步增强了对单个荧光标记细胞的可视化效果。