单分子时间分辨荧光各向异性用于表征生物大分子局部柔性

本研究旨在利用共聚焦显微模式下的时间分辨荧光各向异性，在单分子水平上研究生物大分子的局部柔韧性与动力学特性。单分子检测与定位技术已实现了对生物分子的观测，但要捕捉其动态行为仍需借助其他方法。时间分辨荧光技术有助于填补这一空白。

用于实验研究生物分子动力学的常用工具包括单分子FRET和核磁共振（NMR）。在单分子水平上，可通过多种分析方法对光子逐个发射的荧光信号进行处理，这些方法包括时间分辨分析和爆发方差分析。

在单分子FRET实验中使用多种荧光染料可能会增加实验设计的复杂性，并对制备出足够高质量的样品带来挑战。采用单一标记结合荧光各向异性可解决其中部分复杂问题。

我们发现，人源FoxP1的叉头结构域的单体形式表现为无序蛋白，而在二聚化时其折叠构象的比例增加。

[讲师] 首先，将配制好的标准缓冲液通过孔径为0.22微米的滤膜过滤。然后，再通过活性炭滤膜过滤标准缓冲液，用于单分子采集。对于荧光探针，将配制好的BODIPY荧光探针分装成小体积等份。为校准偏振分辨系统，首先打开平行和垂直探测器通道，并启动蓝色激光器。确保激光功率设定为60微瓦，并打开时间相关单光子计数（TCSPC）软件控制面板。接下来，取1微升100纳摩尔的罗丹明110与49微升蒸馏水混合。在显微镜物镜镜头顶部滴加一滴浸油。将盖玻片放置在显微镜物镜上，并确保水滴位于镜头中央。向盖玻片中心加入50微升稀释后的罗丹明110溶液，用于校准测量。调节成像平面使其位于溶液内部且高于玻璃表面。使用调焦旋钮找到第二个明亮的焦点，并将其调节至1又1/2圈位置。现在，在“时间标记-时间分辨”模式下打开软件，点击“START”按钮。记录120秒的计数率。进行背景测量时，在盖玻片中心加入50微升蒸馏水并重复采集过程。记录300秒的光子计数率，并将文件保存为water.ptu。为进一步进行背景测量，在盖玻片中心加入50微升标准缓冲液。记录300秒的光子计数率，并将文件保存为standard_buffer.ptu。现在启动爆发积分荧光寿命（BIFL）分析软件，点击自动弹出窗口中的“Confirm the setup”。接着点击“Get Parameters From File”，然后点击“OK”。在选择待分析的测量数据时，点击“Data Path Array”，并选择相应的数据集。现在为数组加载water.ptu文件作为绿色散射背景，standard_buffer.ptu文件作为绿色背景，Rhodamine110.ptu文件作为绿色厚样本。在“单分子选择参数”下，点击“Next”，然后点击“Adjust”以打开新的弹出窗口。接着按“Threshold”以修改光子间到达时间，并选择单分子事件的平均光子间到达时间。然后点击“minimum number”以设定每个单分子事件所需的最少光子数。之后通过点击“Return”和“OK”关闭弹出窗口。点击“Color Fit parameters”以使用荧光衰减参数调整绿色及其他颜色的初始荧光寿命。通过调节“from”和“to”值来修改prompt和delay值，然后关闭弹出窗口。最后，点击“Save”以处理ASCII文件，并将其保存至选定文件夹中。将过夜预接种的大肠杆菌C41以1:500的稀释比例转接到含预先添加抗生素的500毫升LB培养基中。在600纳米波长下测定菌液的吸光度以监测其生长情况。当光密度达到0.5至0.7之间时，加入IPTG至终浓度为0.5毫摩尔，诱导蛋白表达，并继续孵育。当菌液光密度达到1.4至1.6时，在4摄氏度条件下以3,000 × g离心20分钟收集菌体。弃去上清液后，将菌体沉淀储存在-20摄氏度直至使用。接下来，向50至100微摩尔的FoxP1蛋白中加入十倍摩尔过量的DTT或TCEP，并进行孵育。使用柱适配器将PD-10脱盐柱放入一个50毫升离心管中，用于缓冲液置换。向柱中加入5毫升PBS缓冲液进行平衡，并在1,000 × g下离心2分钟。将PD-10柱转移至一个新的50毫升离心管中，再向柱中加入2毫升PBS缓冲液。现在将500微升FoxP1蛋白样品加载到柱上。通过在1,000 × g下离心2分钟洗脱柱子，收集纯化的蛋白。将蛋白转移至截留分子量为10千道尔顿的超滤离心管中。在7,500 × g下离心10分钟后，收集浓缩的洗脱液。测定蛋白浓度。然后加入BODIPY，在4摄氏度下于旋转仪上孵育2小时。重复缓冲液置换和蛋白浓缩步骤。在确定蛋白浓度后，使用公式计算标记程度。向腔室载玻片的一个孔中加入495微升超纯水和5微升Tween 20，并充分混匀。室温孵育30分钟后，用超纯水轻轻洗涤腔室两次，并干燥。为校正背景荧光，对缓冲液溶液进行测量。通过采集快速旋转染料的数据，校准平行和垂直探测器的相对灵敏度。在单分子荧光各向异性实验中，针对单体FoxP1，向腔室载玻片中的500微升标准缓冲液中加入100皮摩尔BODIPY标记的FoxP1和100纳摩尔未标记的FoxP1。开始测量，并在BIFL软件中检查30秒内记录的爆发事件数量是否在60至90之间。若样品浓度过高，则进行稀释，直至爆发计数落在该范围内。最后，分析测量结果。单分子荧光各向异性寿命分析揭示了FoxP1 DNA结合域中存在两个不同的旋转相关时间，产生单一分布，表明有序和无序结构集合体共存。爆发方差分析识别出一部分FoxP1分子表现出高各向异性和额外变异，提示存在动态构象变化。光子分布分析区分了FoxP1的单体和二聚体状态，显示出不同的各向异性分布和交换速率。二聚化影响了FoxP1的局部和整体运动，过量方差测量表明在特定半胱氨酸标记位点发生了显著的各向异性变化。动态各向异性分析揭示，FoxP1在二聚化及DNA结合过程中发生部分去折叠，改变了有序和无序群体的比例。