研究铜纳米颗粒诱导的细菌程序性细胞死亡

本研究探讨了铜纳米颗粒对三种常见临床重要细菌的杀菌效果，探究了活性氧生成以及可能涉及的程序性细胞死亡机制。

目前的一个挑战是获得稳定的菌落计数。我认为这源于人为干预。在稀释过程中，细胞的现代化会导致基于位置的虚假计数，与经验更丰富的计数方法相比存在差异。

我们课题组首次利用细胞调节剂研究铜纳米颗粒的杀菌机制，揭示了细菌死亡涉及活性氧生成和自噬等细胞过程。

该方案旨在深入理解铜纳米颗粒杀灭细菌的机制，特别是聚焦于尚未充分研究的细菌程序性细胞死亡通路领域。

通过使用不同的细胞调节剂，我们证实了铜纳米颗粒诱导的细菌死亡涉及自噬和活性氧（ROS）过载，并通过基于可靠重复实验的简单设计确定了关键通路。

[旁白] 首先，从商业供应商处获取粒径为25纳米以及60至80纳米的商用铜纳米粉末。每种粒径的纳米颗粒使用1毫升浓度为1毫摩尔的SDS作为分散剂。然后在室温下使用超声波水浴对纳米颗粒进行至少30分钟的分散处理。接下来，从相应的生物资源中心获取大肠杆菌（Escherichia coli）、鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）菌株。在37摄氏度的好氧条件下，将每种细菌在10毫升LB液体培养基中培养。用LB培养基稀释菌液，使菌液在600纳米处的光密度值达到约0.5。随后使用储备的铜纳米颗粒溶液配制浓度范围为0至100微克/毫升的两种粒径的系列浓度。将500微升菌液移入微量离心管中，在室温下以3,300 G离心10分钟。吸除上清液后，向各管中加入不同浓度的两种粒径纳米颗粒。对照组分别加入500微升磷酸盐缓冲液（PBS）作为阴性对照，以及500微升70%乙醇作为阳性对照。然后将所有样品在37摄氏度、200转/分钟振荡条件下孵育24小时。孵育结束后，用PBS洗涤细菌，并将其涂布于LB琼脂平板上。将平板在37摄氏度下继续孵育24小时。次日，对所有处理组的平板进行菌落计数。分别用5微摩尔SBI处理2小时、0.5微摩尔necrosulfonamide处理1小时、100纳米摩尔wortmannin处理30分钟，或100纳米摩尔Z-VAD处理30分钟，对细菌进行预处理。所有预处理完成后，将各管在3,300 G下离心10分钟。然后将沉淀重悬于800微升PBS中以洗去预处理调节剂。将重悬后的沉淀分装至各管，再次离心后弃去上清液。将沉淀重悬于含纳米颗粒调节剂的混合液中，随后在振荡条件下孵育。此时加入70%乙醇和PBS分别作为阳性和阴性对照。同时设置仅使用抑制剂但不含纳米颗粒的空白对照组。孵育结束后，按1:10体积比加入细胞活力检测试剂并孵育。再次离心培养物后，将上清液转移至96孔板中。使用酶标仪在激发波长560纳米、发射波长590纳米条件下测定荧光强度。将剩余上清液稀释至10⁻⁵和10⁻⁴浓度，涂布于LB琼脂平板进行培养。次日对单菌落进行计数。将菌液移入微量离心管中，随后暴露于405纳米紫外光下照射3小时。接着在45摄氏度下孵育2小时。然后在4摄氏度下继续孵育2小时。冷处理后，将细菌置于3%过氧化氢溶液中处理30分钟。维持一组对照菌株在37摄氏度的LB液体培养基中培养。现在用浓度为1至100微克/毫升的20或60纳米铜颗粒处理细菌，持续24小时。处理后用PBS洗涤细菌两次。离心后，将菌体沉淀重悬于5微摩尔的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate）染料溶液中。在发射波长520或530纳米条件下分析荧光强度。结果显示，1微克/毫升的20纳米铜纳米颗粒和5微克/毫升的60纳米铜纳米颗粒均显著降低了大肠杆菌的菌落计数。金黄色葡萄球菌在两种粒径纳米颗粒的所有浓度下菌落计数均显著减少。在鲍曼不动杆菌中，需使用5微克/毫升的20纳米铜纳米颗粒或10微克/毫升的60纳米铜纳米颗粒才能观察到菌落数量的显著减少。铜纳米颗粒处理可诱导所有测试菌株产生活性氧（ROS），其中20纳米颗粒在较低浓度下即可诱导最高比例的阳性细胞。相比之下，60纳米铜纳米颗粒在所有浓度下均引起持续的活性氧生成。程序性细胞死亡调节剂Z-VAD在低至中等浓度下可提高经两种粒径纳米颗粒处理的大肠杆菌的存活率。NSA处理可提高金黄色葡萄球菌在所有20纳米铜纳米颗粒浓度下的存活率。在暴露于1、5和10微克/毫升的20及60纳米铜颗粒时，Z-VAD可提高鲍曼不动杆菌的存活率；而NSA仅在10微克/毫升的20纳米铜颗粒处理下提高其存活率。