使用荧光染料监测Streptococcus pneumoniae中的膜电位变化、膜完整性及细胞内离子浓度

以下实验的总体目标是利用荧光染料监测细菌系统中膜动力学和细胞内离子浓度的变化。该方法首先在细菌生长阶段将其与目标荧光染料共同孵育，直至染料在其膜两侧达到平衡。随后，用选定的处理剂处理细菌，并监测其荧光信号的变化。

结果可以显示膜去极化、膜完整性和细胞内离子浓度的变化，这些是基于指示染料荧光变化的观察得出的。与用于真核系统的传统电生理技术（如膜片钳）相比，该技术的主要优势在于现在可以利用荧光方法在细菌中监测膜动力学和细胞内离子浓度的变化。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为优化染料浓度需要一定的努力。

上样条件与检测设置：首先从细菌细胞开始。将菌体沉淀用洗涤液重悬，加入至少一毫升磷酸盐缓冲液（PBS），使浓度达到每毫升一亿个菌落形成单位（CFU），此浓度足以进行五个样品的检测。取一毫升洗涤后的菌液转移至微量离心管中，加入25微升一摩尔的滤膜处理液。

将灭菌的葡萄糖储备液加入后，于37摄氏度加热块中孵育细胞15分钟。所添加的葡萄糖量可根据实验需求调整。15分钟后，加入5微升50微摩尔的衰亡染料（dieback）和10微升PI溶液。

用移液器将细胞上下吹打数次，充分混匀。随后将该细胞悬液分装至透明96孔板的五个样品孔中。将96孔板放入预热的酶标仪中，设置为用于检测NP的吸光度读数模式。

现在通过每分钟测量一次，持续 30 至 40 分钟，监测细胞膜上死细胞比例的平衡过程，直至读数稳定至预处理水平。然后取出培养板，加入选定的实验试剂。立即将培养板放回检测仪，并继续监测死细胞比例和碘化丙啶荧光信号，持续所需的时间长度。

进行此步骤时，在配制上样缓冲液的过程中，务必在加入 PBS 和丙磺舒前短暂涡旋混匀。加入这些溶液后，再次涡旋混匀，并用铝箔包裹，随后加入一毫升的 2× 细胞悬液，再加入一毫升的 2× 上样缓冲液。

此用量适用于10个样品。将混合物置于37摄氏度水浴中避光孵育75分钟，在所有这些检测中均需避光。染料浓度和孵育时间可能需要根据特定的细菌种类及其他实验系统变量进行调整，以优化检测效果和基础荧光检测水平。

孵育结束后，每次洗涤均需清洗细胞三次。在2,400 G下离心10分钟以收集细胞沉淀，并将其重悬于含有1×荧光素的2毫升PBS中。三次洗涤后，将细胞在37摄氏度下继续孵育30分钟。

这使得细菌内的酯酶能够水解染料的酯基团，从而使染料在细胞内活化。接下来，离心收集细胞，去除上清液，并将细胞重悬于含有1×丙磺舒的2毫升PBS中。如有需要，可在此时重新加入葡萄糖以恢复细菌的能量状态。每份样品取200微升细胞悬液加入96孔板的一个孔中，并将该板放入预热好的酶标仪中进行单个样品检测。

首先，在适当的波长下，以每秒一次的频率进行一分钟的基线读数测定。然后取出培养板，加入约五微升（5 µL）选定的处理试剂。

迅速用移液器上下吹打数次以混匀处理液，立即放回检测仪中。继续按所需时间进行检测。数据分析时，将每个时间点的荧光值一除以荧光值二，计算其比值，并将比值绘制成图表。

准备过程中，配制一系列 pH 值从 6.5 到 8.0 的高钾缓冲液，共五至六种。与之前步骤相同，使用涡旋振荡器从对数中期培养物的洗涤液中制备 2× 上样缓冲液，并浓缩细胞。然后用 2 毫升 BS 替换 SNAT，以制成 4× 细胞悬液。

将1毫升四倍细胞悬液与1毫升两倍上样缓冲液混合。随后将细胞置于30°C水浴中孵育40分钟。避光操作。

现在将细胞洗涤三次。按照之前所示的方法离心收集细胞。加入含有两倍 prop Benin 和 1 毫摩尔葡萄糖的四毫升 PBS，三次洗涤后再次重复离心。

将细胞在37摄氏度下继续孵育五分钟。为确定背景荧光滤光片，对约500微升活化后的细菌悬液进行灭菌处理以去除细菌。然后将200微升滤液转移至96孔板中，并对该孔的吸光度进行一分钟的测定。

为了获得体内校准曲线，将500微升已加载并激活的ALI瓦茨细胞离心并重悬。将细胞分别悬浮于一系列不同pH值的高钾缓冲液中，每份样品加入20微摩尔的红霉素。这一步可使细胞内的pH值与周围缓冲液的pH值达到平衡。

然后将样品在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，将样品转移至酶标仪中的96孔板。对每个样品的荧光进行数分钟的检测，以建立每个孔的初始读数。

分析数据时，首先减去背景荧光值，然后通过将“值一”除以“值二”来计算荧光值的比值。将每个pH缓冲液对应的比值绘制成图，以生成校准曲线，用于测量细胞内pH的变化。将200 µL活化细胞样品加入到孔板中，每5秒测量一次荧光，持续5分钟。

同时，向一个样本中加入10微摩尔的CCCP，而向其他样本中加入感兴趣的试剂。CCCP作为降低细胞内pH的时间同步阳性对照。立即将培养板放回检测仪，并继续每5秒检测一次荧光，持续10分钟。

作为额外的对照，向所有样品中加入 20 µM 的 NI 盖森，使细菌的 pH 值与缓冲液平衡，持续五分钟。在研究膜极性时，需将细菌与染料避光孵育约 40 分钟，以使染料在膜上达到平衡。这一过程表现为荧光强度持续下降并最终趋于稳定。

PI 不需要平衡，但与退缩现象一起，可用于监测膜破裂。细菌的极性丧失、去极化及破裂表现为两种染料的荧光强度上升，持续时间少于2小时；通过计算两种荧光信号的比值，该比值的升高或降低对应于细胞内钙离子浓度的变化。对于PBFI，通过荧光比值测定细胞内钾离子浓度。

使用B-C-E-C-F am的荧光比值来测量细胞内氢离子浓度。加入钙离子载体霉素后，钙离子流入细胞，导致荧光比值升高。加入缬氨霉素则产生相反效应，引起钾离子流出细胞，表现为荧光比值下降。

B-C-E-C-F 可用于测量细胞内 pH 值，首先需在已知 pH 值的不同缓冲液中建立校准曲线。染料荧光比值的降低对应于 pH 值的下降。如图中黑色曲线所示，在加入质子载体 CCCP 后可观察到该现象，而加入破坏质子驱动力的试剂后则呈现蓝色曲线的结果。

第二个箭头表示添加尼辛，这会平衡细胞内外的氢离子浓度。观看本视频后，您应能充分理解如何测量细菌细胞的膜去极化、膜完整性和细胞内离子浓度。您还应能够利用本方案作为起点，研究其他细菌特性。