一种用于活细胞荧光显微镜观察的电穿孔细胞分析方案——基于U2 OS细胞培养

本研究的范围集中在脉冲电场对细胞行为的影响，特别是电穿孔如何影响细胞周期。

本方案的主要优势在于能够使用哺乳动物细胞培养进行长达72小时的连续活细胞电穿孔实验。本实验室致力于将这些技术应用于微流控领域，这将使后续方案所需的样本量更小、试剂消耗更少，并实现更优的样本控制。

[旁白] 首先，将U2OS FUCCI CA5细胞接种于10厘米培养皿中，加入10毫升含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基。将培养皿置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育。当细胞融合度达到80%时，吸除培养皿中的培养基。用PBS洗涤细胞，随后加入1毫升0.25%胰蛋白酶，孵育1.5分钟以使细胞解离。通过将解离后的细胞重悬于5毫升高糖DMEM培养基中来中和胰蛋白酶。从重悬的细胞悬液中取100微升样品，置于电穿孔细胞分析系统腔室内的底部玻璃盖玻片上。加入样品后，确保腔室的细胞融合度为30%。缓慢地将4毫升高糖DMEM培养基加至腔室的远端，避免液体冲走样品。将标准显微镜载玻片盖在腔室上方，并将腔室置于37°C、5%二氧化碳环境中孵育24小时。打开配备环境控制腔室的倒置荧光显微镜，使系统在电穿孔前达到稳定状态。在环境腔室稳定期间，使用鳄鱼夹导线将数字万用表连接至脉冲发生器电容器和高压开关，以便快速完成与电穿孔腔室的连接。现在，在显微镜上选择20倍放大倍数。在显微镜软件中，选择FITC/GFP和A594 Texas Red M Cherry通道，以对应FUCCI CA5系统中的两种荧光蛋白。使用较低的曝光设置（通常低于0.05秒），以防止长时间成像过程中发生光损伤。在启动延时成像前，拍摄测试图像以优化图像的聚焦和质量。将延时成像程序设置为在24小时内每隔10分钟从3至6个不同视野采集图像，以在减轻光损伤的同时，获得每个延时序列中大量的细胞周期数据。确保A594通道的自动对焦功能已启用，以优化延时过程中对细胞培养物的追踪。在完成电穿孔前，保持软件处于打开状态。将电穿孔细胞分析腔室放入配备合适环境控制腔室的显微镜中。在电穿孔前，保持腔室关闭，并确保环境控制系统持续运行，以维持适当的细胞周期条件。打开环境控制腔室，将数字万用表连接至脉冲发生器，然后使用鳄鱼夹导线将脉冲发生器连接至腔室电极。将脉冲发生器电容器充电至180伏。迅速将脉冲放电至腔室，直至数字万用表显示电压为零。从腔室上移除所有电气连接，并立即重新盖上腔室盖，以确保最佳的培养条件。一旦环境控制腔室稳固就位，立即启动延时成像。延时成像完成后，使用显微镜软件将所有捕获的图像保存为单个视频。调整视觉质量以增强细胞特征的清晰度，便于手动定量分析。最后，观察FITC和A594信号随时间的变化，以在延时视频中追踪细胞周期各时相。利用Fuji系统，通过追踪与蛋白表达和泛素化相关的颜色变化收集视觉数据，从而清晰区分G1、S、G2和M期，实现了在不同条件下对细胞周期进程的直接观察。该图总结了使用非同步化和S期同步化细胞培养物两组实验所获得的关键数据。在非同步化细胞中，脉冲电场暴露显著延长了G1、G2和M期的平均持续时间，而S期保持不变。在同步化细胞中，脉冲电场暴露导致G1、S和G2期持续时间缩短，其中仅S期和G2期具有统计学显著性，而M期未受影响。