基于基质的DNA提取用于污染清除痰液样本的靶向下一代测序

我们的研究是通过结合 NGS 进行个性化患者护理来缩短结核病诊断和随后启动的周转时间。我们的方案通过解决工作流程集成、成本和周转时间来优化 TNGS 的常规使用，旨在减少诊断延迟并改善及时的治疗启动。

与传统的 CTAB 方法相比，该协议允许在数小时内从临床样本中提取具有成本效益、快速且足够质量的 DNA，后者需要长达三天的时间。

我们的结果提出了将 TNGS 整合到常规诊断中以及优化涂片阴性和稀缺样本的提取方法以提高灵敏度和临床实用性的关键问题。我们将探讨常规诊断的残留样本是否可用于下游测序，包括痰液的直接全基因组测序，以简化和扩大结核病基因组监测。

[旁白]首先，获得热灭活的痰沉淀物。以 16,800 G 或全速离心样品 15 分钟。使用 20 至 200 微升移液器轻轻吸出并丢弃上清液，确保沉淀不受干扰。轻轻摇动基质悬浮液进行混合，然后移液 200 微升充分混合的基质以重悬沉淀。将全部体积转移到 1.5 毫升螺旋盖管中，其中包含三个直径为 2 毫米的预灭菌玻璃珠。现在，将样品放入 56 摄氏度的加热块中 15 分钟。孵育后，用涡旋将样品均质化10秒，使细胞分散，然后将样品在100摄氏度的加热块中孵育10分钟。使用高速均质机以每秒4.0米的速度对样品进行均质化，一个循环为60秒。然后，将悬浮液以 12,000 G 离心五分钟。将 130 微升含 DNA 的上清液转移到新鲜的 1.5 毫升低结合管中，而不会干扰沉淀。丢弃第一个装有基质和细胞碎片的试管。使用磁珠纯化DNA，首先在使用前将磁珠储备瓶或配制的等分试样彻底涡旋以重悬珠子，然后在提取的DNA中加入1.2倍体积的磁珠，移液悬浮液10次以混合样品，然后在室温下孵育5分钟。将样品放在 1.5 毫升管磁架上三分钟，或直到液体变清，然后小心地吸出并丢弃上清液，不要干扰珠子。将管子放在磁铁上，加入 200 微升 80% 乙醇，确保珠子不受干扰。孵育 30 秒后，小心地吸出并丢弃乙醇，不要干扰珠子。第二次洗涤后，使用 1 至 10 微升移液器去除任何残留的乙醇。让管子打开，将珠子风干 10 分钟，或直到它们呈现哑光外观。一旦珠子具有哑光外观，从磁铁上取出试管，并将 50 微升无核酸酶水直接添加到每个样品中的珠子上。然后，通过移液 10 次混合每个单独的样品。检查管子里面是否有任何珠子。在室温下孵育五分钟后，将试管放回磁架上三分钟，或直到液体变清。将试管放在磁架上，将含有 DNA 的上清液转移到标记清晰的无菌低结合管中。两毫升沉积物样本中的 DNA 浓度较高，而所有涂片等级的 DNA 浓度均为 500 微升。在 500 微升沉积物样品中观察到 DNA 产量的变异性更大。在所有涂片等级中，两毫升沉积物样本的测序读数覆盖深度高于 500 微升。从 500 微升沉积物中提取的三个涂片级样品的变异性更大。与 500 微升样品相比，2 毫升样品的测序可接受性评分通常更高，高度可接受的结果比例更高。与涂片一加和二加涂片相比，涂片三级以上样本的可接受结果比例最高。500 微升的样品中有更多病例被归类为不可接受或未确定。